桂附地黄丸抗去卵巢小鼠骨质疏松

胡博 刘妍慧 张兆鹏 于子晴 张茹 郭军鹏 (长春中医药大学，吉林 长春 130117)

女性更年期后雌激素减少，成骨细胞和破骨细胞功能均处于亢进状态，由于骨吸收过程相对简单、时间较短而成骨过程复杂、时间较长，导致骨量丢失而形成骨质疏松(OP)。随着中国步入老龄化社会，绝经后OP(PMOP)已成为我国围绝经期妇女常见疾病〔1，2〕。世界卫生组织(WHO)将高血压、OP和冠心病列为三大老年病。目前全世界每年因OP并发骨折的人数达到900万人，二十一世纪中叶骨折发生率会增加2～3倍，而PMOP患者又在其中占四分之三左右〔3〕。由此给患者的肉体和精神带来极大痛苦，同时也给社会造成巨大的负担。

PMOP属慢性退行性疾病，发病隐匿，以雌激素减少为主要原因，还与氧化应激、炎症等因素有关〔4〕。其治疗周期长，对药物依从性有较高要求，目前并未找到较为理想的治疗方案。雌激素替代疗法(HRT)仍是治疗PMOP首选方案，但单纯使用雌激素仅能缓解症状，并不能治愈PMOP，而且长期服用有引起心肌梗死、肺栓塞、阴道出血、子宫内膜癌、乳腺癌的危险性，毒副作用堪忧〔5，6〕。中药如左归丸、右归丸、六味地黄丸、大补阴丸等地黄丸类方已应用于临床治疗OP，疗效好，副作用少〔7〕，但未有学者就桂附地黄丸是否能治疗PMOP进行深讨。本研究通过手术摘除双侧卵巢建立卵巢去势OP小鼠模型，观察桂附地黄丸水煎液对OP小鼠骨强度、骨钙、炎症介质、氧化应激和骨代谢指标的影响，并通过苏木素-伊红(HE)染色观察骨小梁用药前后形态学变化，探索桂附地黄丸对PMOP小鼠的治疗作用。

1 材料与方法

1.1实验动物及试剂 雌性C57BL/6小鼠40只，体重20～22 g，购自辽宁长生生物技术有限公司，实验动物许可证号：SCXK(沈)2020-0001。桂附地黄丸：桂枝、黑附子、熟地等，购自长春中医药大学第三附属医院。戊酸雌二醇(补佳乐)(1 mg/片，国药准字：J20171038)。骨钙素(BGP)、白细胞介素(IL)-6、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)试剂盒，由北京华英生物技术研究所提供。

1.2主要仪器 小动物骨骼强度测定仪(型号为YLS-16A)、低温高速台式离心机(德国贺利式公司)、奥林巴斯BX40显微镜(尼康)、Agilent 5100 ICP-OES(安捷伦科技有限公司)。

1.3分组建模及给药 小鼠随机分组：正常组、模型组、桂附地黄丸水煎液(桂附)组。采用水合氯醛腹腔麻醉后，无菌环境下从背部施行双侧卵巢切除术，除正常组外，模型组、桂附组均摘除双侧卵巢。术后3 d开始药物干预，正常组、模型组自由饮水、进食，桂附组以水煎液0.035 ml/(g·d)灌胃，每天1次，连续干预13 w后采集标本进行分析。

1.4骨强度检测 右侧胫骨标本放置于小动物骨骼强度仪测量支架上(跨距=10 mm)，以1 mm/min速度推压小鼠胫骨中段至断裂，记录数值。实验过程中，保持胫腓骨均完整，且检测过程处于同一水平受力面，以减少测量误差。

1.5骨钙含量测定 将干净的左侧股骨放入恒温干燥箱中，温度(110℃)烘干2 h，观察骨头状态，以完全干燥为准。将干燥完全的骨头样品放入捣药罐中捣碎，称量0.2 g放入消解罐中，随即加入3 ml硝酸和0.5 ml过氧化氢。将消解罐按序号放入仪器中消解60 min，开盖后放入赶酸仪中，温度设置130℃，在通风橱中进行赶酸，至剩余0.5 ml后冷却。定容至100 ml。采用标准曲线法，测定骨钙含量〔8〕。

1.6血清指标检测 取离心后的上清液，按照说明书规范操作，以酶联免疫吸附试验检测血清BGP、IL-6、MDA、SOD水平。

1.7切片及染色 小鼠右侧胫骨放入4%多聚甲醛固定1 w，流水冲洗干净，加入4%乙二胺四乙酸(EDTA)脱钙液2 w。样本完全浸没于脱钙液中，24 h保持轻度摇晃，每24 h更换脱钙液，14 d后完成脱钙。沿矢状面制成5 μm厚度切片，HE染色观察股骨组织形态学变化。

1.8统计学方法 采用SPSS25.0软件进行单因素方差分析。

2 结 果

2.1桂附地黄丸水煎液对骨强度的影响 模型组骨强度〔(1.07±0.06)kg〕较正常组〔(1.22±0.02)kg〕显著降低(P<0.05)；与模型组相比，桂附组骨强度显著增高〔(1.43±0.04)kg,P<0.01〕。

2.2桂附地黄丸水煎液对骨钙含量的影响 模型组股骨钙含量〔(11.22±0.30)mg/g〕显著低于正常组〔(13.30±0.44)mg/g,P<0.01〕，桂附组股骨钙含量〔(12.84±0.20)mg/g〕显著高于模型组(P<0.01)。

2.3桂附地黄丸水煎液对血清细胞因子的影响 模型组BGP、IL-6和MDA水平均较正常组显著升高(均P<0.05)。桂附组BGP、IL-6和MDA水平均较模型组显著降低(均P<0.05)。模型组SOD水平较正常组显著降低(P<0.05)，桂附组较模型组SOD水平显著增高(P<0.05)。见表1。

表1 桂附地黄丸水煎液对血清细胞因子的影响

2.4桂附地黄丸水煎液对骨组织形态学影响 模型组胫骨骨小梁面积减少，排列紊乱，相互交接减少，骨干厚度变薄。与模型组相比，桂附组骨小梁面积增加，排列整齐，间隙变窄，骨干厚度增加。见图1。

3 讨 论

正常情况下人体骨骼处于骨吸收与骨形成的重构，破骨细胞吸收的骨量与成骨细胞新形成的骨量处于动态平衡。骨组织重构包括三个阶段：(1)破骨细胞在骨表面形成环形围堤的溶骨微环境，消化和吸收骨组织，形成凹陷；(2)成骨细胞形成类骨质，填补陷窝；(3)骨基质矿化，钙盐沉积至细胞周围基质中。成年人骨吸收与骨形成持平，骨量保持着恒定状态。女性绝经后雌激素水平下降，破骨细胞的骨吸收作用增强，与成骨细胞的骨形成不平衡，继而导致高转化代谢性OP。PMOP以骨量减低、骨微结构破坏为主要病理特征，并以全身骨痛及易发生骨折为临床特点。

《黄帝内经》《千金方》中有OP相关记载，如“骨痿”“骨枯”“骨痹”“肾痹”等。手不能举，肿痛而逆为骨痹，为冬季外感寒湿邪气，流连骨髓，疼痛甚而影响活动。骨髓减腰脊不举为骨痿，为进展阶段，由外而内迫脏腑，尻以代踵。脊以代头为肾痹，是疾病危重阶段，骨质发生严重变形。中医学认为，“骨应足少阴，少阴气绝则骨枯”，OP病因多归于肾，根本病机为肾精不足。《灵枢·本神》有云：“精伤则骨酸痿厥。”肾为先天之本，主骨生髓，主藏精，肾精是人体重要的精微物质，禀受于父母，上古天真论以女七男八为一个阶段，从人体生长壮老的整体观阐释人体肾精充盈情况在生命过程中的重要作用。肾精充足，则骨髓生化有源，骨骼得骨髓充养濡润而坚固有力，即筋骨劲强，肌肉满壮；肾精虚少，则骨髓生化乏源，不能濡养骨骼，便会出现骨质失养，骨枯不荣，影响骨的代谢。由此可见，早在古代医家对OP的病因、病机和临床表现就已有较为详细和深入的观察和研究。发展至今大家公认：天癸为肾中所藏，父母赋予先天精气，为至阴之精，有至阳之气，阴中含阳，而后天化成形，可以调节生殖、内分泌、充骨养髓的精微物质，主导肾-天癸-冲任-胞宫轴。天癸竭，阴精、阳精均竭〔9，10〕。

研究发现，地黄丸家族通过多种途径对PMOP发挥作用，在临床和动物实验中都取得良好疗效。李微等〔11〕研究发现，右归丸为大补命门火、温补肾阳、填精益髓的方剂，可以调节垂体-肾上腺轴的功能状态，抑制由雌激素下降引起的异常骨吸收。左归丸滋补肾中真阴，通过调节β2肾上腺素受体(AR)介导的人核因子κB受体活化因子(RANK)配体(RANKL)/骨保护素(OPG)信号通路发挥作用。OPG一方面竞争性结合RANK，抑制RANK与RANKL结合，削弱RANKL促进骨吸收；另一方面OPG受雌激素调控，作用于破骨细胞抑制骨吸收。另外，左归丸通过上调雌激素受体的表达，继而激活人骨形态发生蛋白(BMP)2/RUNT相关转录因子(RUNX)2信号通路而参与骨代谢过程，增加骨矿含量和骨密度，增加雌激素分泌，明显改善OP模型鼠的骨生物力学作用，实现对卵巢摘除OP模型小鼠的骨保护作用。于雪冰等〔12〕研究发现，滋补肾阴的经典方剂六味地黄丸可能调节Janus激酶(JAK)/信号转导和转录激活子(STAT)信号通路，促进BGP合成，有效升高骨密度而改善PMOP。李玉星〔13〕研究发现，六味地黄丸对PMOP模型大鼠有早期干预作用，与模型组比较，六味地黄丸组可提高模型组大鼠骨密度及雌激素、钙、磷水平，明显减少骨小梁断裂和髓腔内脂肪细胞的比例，减少模型组肥胖的发生，最终延缓PMOP发生发展。张倩等〔14〕研究发现金匮肾气丸可通过影响碱性磷酸酶、IL-6、OPG的表达，从而抑制破骨细胞活性，促进骨形成，继而改善骨组织微结构，提高骨密度，改善OP。 陈一洲等〔15〕研究发现金匮肾气丸通过调节Wnt/β-catenin信号通路及下游Osterix、碱性磷酸酶成骨基因表达，进而调控骨髓间充质干细胞成骨分化，有效防治去势小鼠OP。

桂附地黄丸源于《金匮要略》，是地黄丸类祖方，具有阴阳双补之功效〔16〕。方中地黄、山茱萸归肝肾经，补益肝肾阴而摄精气；山药、茯苓性味甘平，入脾，健脾渗湿，泽泻倾泄肾中水邪；丹皮清肝胆相火；桂枝、附子补火助阳，逐血痹、温补命门真火。上述诸药合用，集寒热补泻药之大成，共奏平补肾阴肾阳之效。

双侧卵巢切除术造模使实验动物雌激素减少，骨吸收增强，骨代谢呈负平衡，骨量逐渐丢失，形成OP。由于性激素的分泌减少，引起炎症因子、活性氧分子增加及加速钙磷代谢紊乱导致的骨丢失也是PMOP重要原因。研究表明，炎症与OP存在明显关系〔17〕。炎症因子如IL-1、IL-4、IL-6等都能通过调节骨吸收的途径影响OP。破骨细胞前体位于骨髓中，属于单核巨噬细胞家族成员。许多炎症因子有促进破骨细胞分化和成熟的功能，在此过程中通过多条途径对成骨细胞的凋亡和增殖分化进行调控。结果导致破骨细胞分裂增殖，成骨细胞凋亡，从而直接促进骨吸收导致OP发生。IL-6是由T细胞、B细胞、巨噬细胞等免疫细胞和破骨、成骨细胞分泌，以旁分泌形式作用于邻近靶细胞，促进破骨细胞形成并抑制成骨细胞分化〔18〕。 IL-6在靶细胞膜上与跨膜的IL-6受体形成受体复合物后〔19〕，进一步招募gp130同源二聚体，通过gp130向下发出信号激活JAK2/STAT3等信号通路，从而促进RANKL并抑制OPG表达，进而间接地增强破骨细胞的骨吸收，加速骨丢失。IL-6作为免疫系统的重要细胞因子，可直接激活破骨细胞活性，导致骨吸收活动增加，促进OP发生发展。本研究结果说明桂附地黄丸可能通过调控体内炎症水平、抑制破骨分化而抗OP。研究表明〔20，21〕，氧化应激与骨形成率下降及成骨细胞和骨细胞凋亡增加密切相关。SOD是体内重要的抗氧化酶，能够有效清除过氧化产生各种活性自由基，减轻氧化应激损伤。MDA是体内脂质过氧化的产物，能够间接反映氧化应激的程度〔22〕。本研究结果说明桂附地黄丸可能通过调节炎性反应和氧化应激反应共同发挥抑制破骨细胞分化、维持骨稳态的作用。BGP是由成骨细胞合成及分泌到骨组织中调节和维持骨钙的非胶原蛋白，占骨基质蛋白5%，其中70% BGP同羟基磷灰石结合后沉积于骨基质中，余下30%分布于血液中，血清中BGP含量反映成骨细胞矿化功能及活性，是骨组织维持正常矿化速度的关键〔23〕。

骨重建过程中钙、磷代谢在体内维持动态平衡是保证骨代谢正常进行的物质基础。骨中的无机盐称之为骨盐，主要成分为磷酸钙盐，是由钙和磷共同形成的磷灰石结晶，占骨盐成分的84%。研究显示，OP大鼠骨钙丢失的同时，血清中钙含量也同步变化，两者之间有一定的相关性〔24〕。

综上，绝经后妇女体内雌激素合成减少，炎症因子分泌增加，抗氧化作用减弱，破骨细胞增殖、分化和成熟增多，造成骨量丢失，最终导致OP。桂附地黄丸能抑制PMOP小鼠骨组织的炎症与氧化应激反应，改善骨组织钙磷代谢而发挥防治PMOP作用。