神经肽P物质通过Ca2+和CREB诱导自然杀伤细胞的活化作用

赵蔓嘉，范世光，赵爱农，梁再赋，傅炜昕

（中国医科大学科学实验中心，沈阳 110122）

P物质（substance P，SP）最初被认为是感觉神经递质，广泛分布于中枢和外周神经系统，可参与机体多种生理病理过程，包括疼痛感知，免疫细胞增殖、趋化及炎症等，并在心血管、呼吸和消化系统中发挥作用［1-3］。许多免疫细胞也可产生SP，SP在免疫系统中以旁分泌和自分泌的形式调节免疫细胞功能，如促进免疫细胞增殖和分化，影响免疫球蛋白的合成及细胞因子分泌等［4-5］。SP还通过调节趋化因子和黏附分子的表达，对免疫细胞的迁移发挥重要调节作用［5-6］。SP的生物学功能由3种受体NK-1R、NK-2R、NK-3R介导，其中NK-1R与SP的亲和力最高，故NK-1R为主要介导者［7-8］。研究［9］表明，NK-1R信号转导通路是T细胞活化的最佳Ca2+通量所必需的。CD4和CD8 T细胞都表达功能性NK-1R，在同源T细胞活化过程中自分泌/旁分泌的SP激活NK-1R信号转导通路，从而增加T细胞受体（T cell receptor，TCR）信号转导后的Ca2+通量，这种作用对于后续的启动白细胞介素-2（interleukin-2，IL-2）合成、T细胞存活以及辅助性T（helper T，Th）细胞1和Th17细胞极化的下游信号通路是必需的。

自然杀伤（natural killer，NK）细胞是固有免疫的主要承担者，在机体早期抗感染、抗肿瘤免疫中发挥重要作用［10-11］。NK细胞识别靶细胞后激活，受控于自身共表达的活化性受体和抑制性受体的动态信号平衡［11-13］。研究［14-15］证明，SP对NK细胞功能具有调节作用，SP可刺激NK细胞迁移及细胞毒活性［6，15］。另有研究［16］发现，某些病理状态下，循环SP浓度升高可损伤NK细胞功能，抑制NK细胞杀伤活性。说明SP在不同条件下对NK细胞的作用不同，提示SP对NK细胞的调控作用具有复杂性和多样性，SP主要通过NK-1R调节NK细胞功能［16-17］，但确切的信号通路及机制还不十分明确。本研究选用NK92-MI细胞作为研究体系，体外研究SP对NK92-MI细胞增殖、杀伤活性的影响，并探讨SP受体NK-1R在SP调控NK细胞活性中的作用及可能的信号分子机制。

1 材料与方法

1.1 材料

NK92-MI细胞为非IL-2依赖的NK92细胞株，购自中科院上海细胞库。SP购自美国Sigma公司。抗NK-1R单克隆抗体、抗环磷酸腺苷反应元件结合蛋白（cyclic adenosine monophosphate response element binding protein，CREB）/p-CREB单克隆抗体购自美国Abcam公司。FITC标记的二抗购自北京鼎国昌盛生物技术有限公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养：用含12.5%胎牛血清和12.5%马血清的α-MEM培养基（不含RNA和DNA），在37 ℃、5%CO2培养箱中传代培养NK92-MI细胞。

1.2.2 MTT释放法检测SP对NK92-MI细胞增殖的影响：NK92-MI细胞（1×105/mL）接种于96孔培养板（100 μL/孔），加入10-12mol/L的SP（100 μL/孔），于37 ℃、5%CO2培养箱中孵育；分别于孵育24、48和72 h加入MTT液，继续孵育4 h；加入DMSO和甘氨酸缓冲液溶解甲臜结晶，用酶标仪于570 nm处测定吸光度（optical density，OD）值。用特异性NK-1R拮抗剂［D-Arg1，D-Phe5，D-Trp7，D-Trp9，Leu11］ SP（10-7mol/L）预处理NK92-MI细胞30 min，再用10-12mol/L SP作用48 h，MTT法检测NK92-MI细胞的增殖活性。

1.2.3 MTT释放法检测SP对NK92-MI杀伤活性的影响：（1）将4×105/mL的NK92-MI细胞作为效应细胞接种至96孔培养板（100 μL/孔），加入10-12mol/L SP（100 μL/孔）作用24 h；将1×105/mL的K562细胞作为靶细胞，接种至实验孔（100 μL/孔），使效靶细胞比为4 ∶1；效靶细胞共同孵育4 h后，加入MTT液孵育4 h；加入DMSO和甘氨酸缓冲液，振荡15～20 min后，用酶标仪测定570 nm OD值。计算NK-92MI细胞对K562细胞的杀伤率，杀伤率（%）=［1-（杀伤实验组OD值-效应细胞对照组OD值）/靶细胞对照组OD值］×100。（2）用特异性NK-1R拮抗剂预处理NK92-MI细胞30 min，再用10-12mol/L SP作用24 h，MTT法检测NK92-MI细胞对K562细胞的杀伤活性。

1.2.4 荧光定量PCR：采用TRIzol法提取NK92-MI细胞总RNA，经37 ℃、15 min反转录，反应体系10 μL［5×Prime ScriptTMBuffer 4.0 μL，Prime ScriptTMEnzyme MixⅠ 0.5 μL，50 μmol/L Oligo dT primer 0.5 μL，100 μmol/L random 6 mers 0.5 μL，total RNA（﹤500 ng）1.0 μL，RNase Free dH2O 3.5 μL］。PCR反应为两步法，95 ℃30 s预变性；95 ℃5 s，60 ℃34 s，40个循环。PCR反应体系20 μL ［SYBY Primix Ex TaqTM（2×）10 μL，PCR上下游引物（10 μmol/L）各0.4 μL，ROX Reference Dye Ⅱ（50×）0.4 μL，模版cDNA 2.0 μL，dH2O 6.8 μL］。用Primer Premier 5.0 软件设计NK-1R引物，由金思特科技有限公司（南京）合成。引物序列，正向5’-TCCACTAACACCTCGGAACC-3’，反向5’-ACA GGCCGTAGTACCATTGG-3’。应用ABI PRISM 7500 Real-Time PCR System进行检测，以18SrRNA作为参照基因，用2-ΔΔCt法比较实验组相对表达量与对照组的倍数差异［18］，ΔΔCt=实验组ΔCt-对照组ΔCt。

1.2.5 流式细胞术检测NK-1R的膜表达：用10-12mol/L SP处理NK-92MI细胞24 h，收集、洗涤细胞，加入无标记的抗NK-1R单克隆抗体，4 ℃孵育40 min；洗涤细胞后，再加入FITC标记的二抗，4 ℃继续孵育40 min，洗涤细胞后应用FACScan流式细胞仪进行检测分析。

1.2.6 Fura-2/AM荧光探针法检测NK92-MI细胞胞质钙浓度：用10-12mol/L SP处理NK-92MI细胞1 h，收集、洗涤细胞，加入Fura-2/AM/DMSO液（终浓度为5 μmol/L），37 ℃避光振荡孵育30 min；洗涤细胞后于25 ℃放置30 min，使Fura-2/AM完全去酯化；上机测定荧光强度F，加入10%Triton X-100（10 μL），测定饱和Ca2+溶液的荧光强度Fmax；各管加入EGTA 10 μL，测定零Ca2+溶液的荧光强度Fmin。按下列双波长探针测定的计算公式计算胞质Ca2+浓度，钙含量［Ca2+］=Kd×（R-Rmin）/（R-Rmax）×F2min/F2max，R=Fλ1/ Fλ2，Rmin=F1min/F2min，Rmax=F1max/F2max。Fλ1和 Fλ2分别为在波长λ1与λ2时的荧光强度；F1min和F2min分别为零Ca2+溶液在波长λ1与λ2时的荧光强度；F1max和F2max分别为饱和Ca2+溶液在波长λ1与λ2时的荧光强度。

1.2.7 Western blotting测定CREB磷酸化水平：用10-12mol/L SP作用NK-92MI细胞1 h，收集1×107个细胞，提取细胞总蛋白并定量，行聚丙烯酰胺凝胶电泳。室温、50 V（100 mA）转印PVDF膜3 h。转印膜漂洗后，加入封闭液（10%牛奶）于4 ℃摇床封闭过夜。加入抗CREB/p-CREB单克隆抗体（1 ∶1 000稀释），室温孵育2.5 h；漂洗后，加入二抗（1 ∶2 000稀释）孵育1 h。以β-actin作为内参照。用ECL试剂显影、检测。

1.3 统计学分析

采用SPSS 13.0软件进行统计学分析。数据以表示，组间比较采用单因素方差分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 SP促进NK92-MI细胞增殖活性

MTT结果显示，10-12mol/L SP可促进NK92-MI细胞的增殖活性，且作用48 h促增殖活性最强（图1A）。NK-1R拮抗剂可完全阻断SP的促增殖活性（图1B）。提示SP通过NK-1R发挥其对NK细胞的促增殖活性。

图1 SP对NK-92MI细胞增殖活性的影响Fig.1 Effects of SP on NK-92MI cell proliferation

2.2 SP对NK92-MI细胞杀伤活性的影响

MTT结果显示，经10-12mol/L SP作用24 h后，NK92-MI细胞对K562细胞的杀伤活性（效靶细胞比为4 ∶1）明显增强（P<0.01），且NK-1R拮抗剂可大部分阻断SP的增强作用（图2）。

图2 SP对NK92-MI细胞杀伤活性的影响Fig.2 Effects of SP on NK-92MI cell killing activity

2.3 SP启动NK-1R受体及Ca2+信号通路

荧光定量PCR结果显示，10-12mol/L SP作用1 h即可促进NK92-MI细胞的NK-1RmRNA表达，作用4 h使NK-1RmRNA表达上调至最高水平；至24 h时，NK-1RmRNA表达水平回落至正常（图3A）。10-12mol/L SP作用1～4 h，NK92-MI细胞的NK-1R膜表达无明显变化，作用至24 h，NK-1R的膜表达明显增加（图3B、3D）。同时发现，SP作用1 h即可引起NK92-MI细胞胞质Ca2+浓度明显升高，而作用至24 h，Ca2+浓度回落至基础水平（图3C）。上述结果表明，SP通过增加NK-1R的表达及激活Ca2+信号通路，发挥对NK92-MI细胞活性的调节作用。

图3 SP对NK-1R及Ca2+信号通路的作用Fig.3 Effects of SP on NK-1R and Ca2+ signaling pathway

2.4 SP诱导NK92-MI细胞CREB磷酸化

选择NK-1RmRNA表达水平和Ca2+浓度均增高的时间点，检测CREB的磷酸化状态。结果显示，未受SP作用的NK92-MI细胞p-CREB水平较低，10-12mol/L SP作用1 h后p-CREB的水平明显增高，表明SP可诱导CREB磷酸化而活化CREB。

图4 SP诱导NK-92MI细胞CREB磷酸化Fig.4 SP induces CREB phosphorylation in NK-92MI cells

3 讨论

本研究发现，SP可有效促进NK92-MI细胞的增殖和杀伤活性，且该促进作用可被SP受体（NK-1R）拮抗剂完全阻断和大部分阻断。另一方面，SP可诱导NK92-MI细胞NK-1R的表达增加，说明SP可通过NK-1R的表达来介导其对NK92-MI细胞活性的促进作用。

NK-1R广泛分布于神经系统和免疫系统，且在免疫系统中主要参与介导调节功能［6，19］。NK-1R为G蛋白耦联受体（G protein-coupled receptors，GPCRs），与高亲和性配体相互作用，通过不同的G蛋白产生不同的第二信使而发挥作用。主要有2条下游信号转导途径，环磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）信号途径和磷脂酰肌醇信号途径。NK-1R与Gαq蛋白作用诱导磷酯酶C活化，导致胞内三磷酸肌醇（inositol triphosphate，IP3）和甘油二酯迅速产生，并增加胞质Ca2+作为第二信使［9，11，20］。cAMP则被与NK-1R结合的Gαs蛋白激活［5，11］。NK-1R与SP结合活化可激活几种第二信使，包括钙（Ca2+）、IP3、蛋白激酶C、促分裂原活化蛋白激酶和转录因子核因子κB及CREB等［20-21］。SP与NK-1R结合通过Gαs激活腺苷环化酶，使cAMP水平升高，而激活依赖于cAMP的蛋白激酶A（protein kinase A，PAK）；活化的PAK进入细胞核内，使转录因子CREB磷酸化，从而具有转录活性，启动下游基因的转录，完成信号转导途径［21-22］。

前期研究［17］结果显示，SP通过NK-1R介导胞质Gαs的上调和Cαi信号通路参与了其增强NK92-MI细胞杀伤活性及对杀伤介质穿孔素和颗粒酶B表达的促进作用。本研究结果表明，SP可促进NK92-MI细胞胞质Ca2+浓度迅速升高，提示Ca2+依赖的信号通路启动了NK-1R，或部分参与了NK-1R介导的SP活化NK92-MI细胞的信号转导。

本研究结果显示，SP通过增加CREB的磷酸化而活化CREB。CREB是一种碱性亮氨酸拉链转录因子，可由细胞外调节蛋白激酶、Ca2+和应急刺激等信号通过Ser133位点的磷酸化来激活，继而选择性活化一系列下游基因［23-24］。前期研究数据表明，SP可在转录水平调节NK细胞的活性，即上调杀伤介质穿孔素、颗粒酶B以及受体NCRs、NKG2D和NKG2A的mRNA水平。

综上所述，本研究发现cAMP通路参与了NK-1R介导的SP对NK92-MI细胞的活化，且Ca2+和CREB是关键信号分子，这些结果有助于更好地了解SP调控NK细胞功能的作用机制。