矿化胶原膜浸提液对MG-63人骨肉瘤细胞分化 相关基因表达的影响

韩 雪 赵海丹 王 辰 李大伟 刘 振 许亦权

（中国人民解放军总医院第八医学中心口腔科，*骨科，北京 100091）

复合纳米羟基磷灰石的新型矿化胶原膜是一种无免疫原性的可吸收的胶原膜，由致密层和疏松层组成，疏松层的主要成分是羟基磷灰石和I型胶原蛋白，模拟天然骨成分，具有良好的成骨诱导活性。与进口的Bio-gide膜相比较，成本降低，前期工作也证实其具有良好的体外细胞相容性。MG-63人骨肉瘤细胞系广泛用于材料的体外生物相容性评价和机理研究，在增殖和分化期都表达成骨相关基因。碱性磷酸酶（Alkaline phosphatase，ALP）、I型 胶 原（Collagen Type I，COL I）、骨保护素（Osteoprotegerin，OPG）、骨钙素（Osteocalcin，OC）和其他因子在不同分化阶段将被上调或下调。研究发现生物医用材料的组成、结构和培养条件也会改变成骨细胞分化相关基因的表达。因此可以通过ALP、COL I、OPG和OC等骨分化相关基因的表达来评估细胞的分化能力。

市售胶原膜（Bio-gide）是临床中常用的比较成熟的引导骨再生膜材料，本研究以Bio-gide膜作为对照材料，通过实时定量聚合酶链反应（RTPCR）测定并分析成骨分化相关基因的表达，来评估新型矿化胶原膜是否具有促进人成骨样MG-63细胞的成骨相关功能，为引导骨再生膜材料的临床选择提供可能的理论依据与实验依据。

1 材料和方法

1.1 实验细胞和试剂

1.1.1

实验细胞 MG-63人骨肉瘤细胞（简称：MG-63细胞）购自中国医学科学院基础医学研究所。

1.1.2

主要试剂和设备 矿化胶原膜（奥精医药科技有限公司，北京）；Bio- gide 膜 （Geistlich Pharma AG，瑞士）；MEM培养液、胎牛血清（FBS）、胰蛋白酶、双抗（中国医学科学院基础医学研究所，北京）；RNA提取试剂盒（康为世纪生物科技有限公司，北京）；M-MLV反转录酶（Promega公司，美 国），RNasin（Thermo公 司，美 国），SYBR Green 荧光定量 PCR试剂盒（TOYOBO，日本）；倒置相差显微镜 （Leica公司，美国）；CO细胞培养箱（SANYO，日本）；超净工作台（东联哈尔仪器制造有限公司，北京）；离心机（Thermo，美国），PCR仪（Applied Biosystems，美国）；荧光定量PCR仪（BIO-RAD，美国）；平底6孔板（Corning公司，美国）。

1.2 方法

1.2.1

浸提液的制备 参照 ISO10993-5：2009医疗器械生物学评价第5部分 细胞毒性试验体外法，将Bio-gide生物膜和矿化胶原膜按6 cm/ mL的比例置于含10%FBS的MEM培养液中，在37℃培养箱中浸提24 h，浸提后0.22 μm微孔滤膜过滤除菌，4℃保存备用。实验分3组：空白对照组（10%FBS的MEM培养液）、同类产品对照组（Bio-gide膜）及矿化胶原膜组。

1.2.2

细胞培养 MG-63细胞复苏后，加入含有10%FBS的MEM培养液，置于 CO培养箱培养。隔天换液，待细胞长满80% ～ 85%时，按1∶3传代到新的培养板中。取对数生长期的MG-63细胞，以2×10的密度接种在培养板中，24 h 后更换为不同材料浸提液，并设置不加材料浸提液的空白对照组，每3天换液，培养7 d、14 d后收集细胞。

1.2.3

总RNA提取 按照试剂说明，利用细胞 RNA提取试剂提取细胞总 RNA。将得到的RNA用RNase-Free Water溶解， 取少量进行琼脂糖凝胶电泳，130 V，15 min。利用凝胶成像系统照相。

1.2.4

cDNA的合成 取1 μgRNA加入2 μl oligo dT、2 μl dNTP，利 用RNase-free ddHO补 齐14.5 μl，70℃水浴5 min，冰浴2 min后加入4 μl 5×反应缓冲液、0.5 μl RNase抑制剂及1 μl逆转录酶， 42℃孵育50 min；72℃孵育5 min。

1.2.5

Real-time PCR 参照Genbank cDNA序列设计ALP、COL I、OPG、OC引物序列， 合成引物，具体引物序列见表1。PCR反应体系如下：10 μlSYBR green Kit Master Mix（2×）、 0.5 μl上、下游引物 （ 10 μM） 、 1 μl cDNA，灭菌蒸馏水补足至20 μl。 PCR反应条件：95℃预变性 3 min，95℃ 10 s、 60℃ 10 s，72℃ 10 s，40个循环。将内参GAPDH表达量做为基线，计算各组mRNA的相对表达量。

表1 mRNA的引物序列

基因名称 引物序列（5’—3’）ALP ATCGCCTACCAGCTCATG GTTCAGCTCGTACTGCATGTC COL I ATGTCTAGGGTCTAGACATGTTCA CCTTGCCGTTGTCGCAGACG OPG GGGGACCACAATGAACAAGTTG AGCTTGCACCACTCCAAATCC OC CTCACACTCCTCGCCCTATT GGTCAGCCAACTCGTCCAG GAPDH TGACATCAAGAAGGTGGTGA TCCACCACCCTGTTGCTGTA

1.3 统计学分析

采用SPSS 17.0统计软件分析实验结果，组间均数比较采用单因素方差分析，

P

＜0. 05为差异具有统计学意义。

2 结果

本实验通过 RT-PCR 法检测 3 组MG-63细胞的ALP、 COL-Ⅰ、OPG和OC mRNA （messenger ribonucleic acid）相对表达量，结果得出，在ALP、OPG基因相对表达量检测中，3 组成骨细胞的基因表达量差异无统计学意义（

P

＞0.05）（图1，图2）；在COL I与OC基因相对表达量检测中，14天时Bio-gide组和矿化胶原膜组表达明显上调，与空白对照组相比，差异有统计学意义（

P

＜0.05），而矿化胶原膜组与Bio-gide组相比，差异无统计学意义（

P

＞0.05）（图3、图4）。

图1 MG-63细胞经各组培养基培养第7天、第14天后ALP表达的相对值

图2 MG-63细胞经各组培养基培养第7天、第14天后COL I表达的相对值

图3 MG-63细胞经各组培养基培养第7天、第14天后OPG表达的相对值

图4 MG-63细胞经各组培养基培养第7天、第14天后OC表达的相对值

3 讨论

原代成骨细胞虽然适用于体外细胞学研究的各个方面，但因为不能完全控制细胞供体的纳入标准，分离得到的成骨细胞表型在一定程度上会受到受体相关因素的影响，难以做到对供体年龄、性别和取材位置标准化的控制。MG63成骨样细胞与人原代成骨细胞的分化相关特征性蛋白的种类高度相似，取材方便，不受伦理问题的约束，通常被用作替代人原代成骨细胞的标准细胞模型，广泛用于评估生物医用材料的体外细胞学研究。

本实验选用的矿化胶原膜为双层膜，疏松层以胶原分子为模板，引导钙离子、磷离子在特定位点形成羟基磷灰石晶核，并使胶原纤维之间和表面形成周期性有序排列的羟基磷灰石晶体，从而微观呈多孔结构，孔径 50 ～ 500 μm，孔隙率＞70%，这种类似天然松质骨的化学成分和微观结构，为成骨细胞的活动提供良好的微环境和支架作用，促进新骨形成；致密层为Ⅰ型胶原，发挥屏蔽作用。

MG-63细胞可作为良好的分化和矿化模型，碱性磷酸酶（ALP）、I型胶原（COL I）、骨保护素（OPG）和骨钙素（OC）在MG63细胞不同的分化过程中有所表达。为研究各组材料对MG-63细胞成骨分化的影响，我们测定了ALP、COL I、OPG、OC等成骨分化相关基因的表达情况。本研究将MG-63细胞与矿化胶原膜和Bio-gide生物膜浸提液共培养，利用荧光定量RT-PCR方法检测两种材料浸提液中MG-63细胞骨分化相关的基因表达水平，结果发现，两者比较无显著性差异，但在14d时，两组细胞中COL-I和OC mRNA的表达量高于对照组，说明新型矿化膜和Bio-gide膜的浸提液可上调COL I和OC mRNA的表达水平，说明这2种膜材料本身在成骨方面所具有的生物活性，在一定程度上可促进成骨细胞的分化功能，同时也证明矿化胶原膜的生物活性与Biogide生物膜相似。COL I和OC由成骨细胞分泌，是成骨细胞在骨基质形成过程中重要的基因产物，其分泌异常将直接影响骨基质的形成。其原因可能与两种膜材料可释放某种生物活性肽，而细胞膜表面有丰富的膜受体参与传导生化信号，可与生物活性肽结合调控细胞的分化水平，从而对成骨产生促进作用。

4 结论

本实验通过RT-PCR检测成骨分化相关基因（ALP、 COL-I、OPG和OC mRNA）的表达，发现矿化胶原膜可促进成骨细胞骨向分化相关基因COL-I mRNA和OC mRNA的表达，这些基因可能参与新骨形成，在蛋白质水平的影响还需要进一步进行实验研究。矿化胶原膜为实现组织引导再生胶原膜材料的国产化提供了一种新型材料，值得进一步的深入研究探索。