CRISPR/Cas9基因编辑技术在植物病原真菌中的应用研究进展

夏雄飞 潘俊良 韩长志

摘要：CRISPR/Cas9是在细菌、古细菌基因组中含有的一种成簇有规律的间隔短回文重復序列，该结构被其用于抵御外来微生物基因入侵。通过对上述结构进行改装从而形成一种基因编辑方法，与传统的锌指核酶和转录激活因子样效应物核酶基因编辑方法相比，CRISPR/Cas9基因编辑技术具有更高效的优势。本文以CRISPR/Cas9系统的组成、作用机制和运用原理为切入点，系统总结了该技术在植物病原真菌（稻瘟病菌、橡胶树胶孢炭疽菌、玉米黑粉病菌等）中的致病相关基因组定点编辑应用情况，明确了当前在植物病原真菌中应用CRISPR/Cas9系统的编辑效率整体较低，不同sgRNA设计工具、目的等对编辑效率、靶向特异性的潜在影响，以及宏观突变检验方式的偏差问题等局限性，并提出了该系统应用范围的扩大、编辑效率的提高以及新型编辑方式的挖掘等建议与展望。

关键词：CRISPR/Cas9;植物病原真菌;基因编辑;研究综述

中图分类号： S432.4+4文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2022）12-0022-06

收稿日期：2021-09-03

基金项目：国家自然科学基金（编号：31960314）;云南省“兴滇英才支持计划”青年人才专项（编号：YNWR-QNBJ-2020-188）;云南省应用基础研究计划（编号：2018FG001-028）。

作者简介：夏雄飞（1996—），男，安徽合肥人，硕士研究生，主要从事资源利用与植物保护研究，E-mail：616385792@qq.com;共同第一作者：潘俊良（1988—），男，上海人，硕士研究生，主要从事资源利用与植物保护研究，E-mail：panjunliang@sh.chinamobile.com。

通信作者：韩长志，博士，教授，主要从事经济林木病害生物防治与真菌分子生物学研究。E-mail：hanchangzhi2010@163.com。

目前，CRISPR/Cas9（clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated 9）基因编辑技术在实现对植物、动物以及微生物等特定基因条件性敲除、敲入、替换、修复等方面具有较为广泛的应用，弥补了锌指核酸内切酶（ZFNs）和类转录激活因子效应物核酸酶（TALENs）等传统编辑技术的劣势[1]。该技术具有设计过程简单、同时多位点编辑等优点[2]，可广泛应用于医药、农业及工业等领域，目前在构建动物、细胞系模型以及癌症治疗[3]、良种育种[4]以及工业微生物改造[5]等方面已经得到了实践验证。2020年10月，法国科学家埃玛纽埃尔·沙尔庞捷和美国科学家珍妮弗·杜德纳以CRISPR/Cas9技术开发者身份获得诺贝尔化学奖[6-7]。植物病原真菌对农林业造成重要危害，对社会、经济等各方面产生重大影响。前人对于病原真菌的基因研究，多采用单基因敲除的方式以挖掘新的致病基因，由于某些真菌发生同源重组效率较低，缺乏启动子和有效的转化子筛选标记以及相对复杂的遗传性，严重影响致病机制的解析[8]。当前学术界对于真菌基因编辑的综合分析多集中于工业丝状真菌以及食药用大型真菌等，然而尚未见对该技术在植物病原真菌中的应用进行对比分析，本文以稻瘟菌、橡胶树胶孢炭疽菌、玉米黑粉菌、链格孢霉、小球腔菌、镰刀菌等6种病原真菌为例，对前人所开展的CRISPR技术相关应用展开综述，并对其研究思路、方法、内容、结果以及对后续相关研究的影响等展开解析，以期为进一步开展该领域的科学研究提供重要的理论指导。

1 CRISPR/Cas9系统基本原理

CRISPR/Cas9基因序列主要由Cas9、前导序列、间隔序列、前间隔序列临近基序（PAM）以及重复序列组成。单链向导（sgRNA）源自于间隔序列的转录加工，由于sgRNA的部分母DNA来自外源基因，所以其能够与目标外源基因上源间隔序列特异性互补配对。sgRNA通过识别PAM并引导Cas9复合体与目标基因特异性结合并剪切[9]。基于此原理，人工设计出一种可识别并靶向设计者意向基因的sgRNA，同时将sgRNA和Cas9进行定向优化，诸如添加核定位序列（NLS）、核酶序列等以提高编辑效率[10-11]，sgRNA将引导Cas9准确剪切目标基因，基因的删除激发了细胞内DNA的同源修复（HDR）或非同源末端连接（NHEJ）修复。对于HDR途径，能够较准确地替换部分目标基因，但外源序列要与目标序列具有高同源性才能实行HDR;对于NHEJ途径，其双链断裂的位置则会发生随机的插入或删除（图1）。

2 CRISPR/Cas9系统在植物病原真菌中的应用

2.1 稻瘟菌

稻瘟菌引起的稻瘟病是水稻种植最主要的威胁，在我国发病水稻面积每年高达380万hm2，产量损失占到总产量的10%～30%[12]。Arazoe等最先对稻瘟菌建立了CRISPR系统，成功阻断了小柱孢酮脱水酶基因（SDH）的表达，并发现了利用U6启动子编辑效率相比TrpC启动子更高[13]。尽管总体效率偏低，且突变体DNA无法稳定自我复制[14]，但为该系统在稻瘟菌中的运用奠定了基础。为了解决上述问题，Foster等在前人研究基础上进一步设计出了应对稻瘟菌的RNP-CRISPR-Cas9编辑系统，结果显示靶向ALB1基因的效率均大于50%，产生70%～80%的转化子。此外，他们还开发了一种“共同编辑”策略，即将2个独立的RNP核糖核蛋白（Cas9-NLS-sgRNA）一起转化至稻瘟菌，一部分细胞会同时占据2个RNP并被编辑2处，如果其中一个基因具有易于观察的表型，即可用作选择标记筛选转化子，然后确定第2个基因是否也被编辑，该方法在最大程度上避免了脱靶，但效率仅有0.5%～2.0%，在后续研究中可以尝试通过转化方式替换或调整RNP与供体DNA比例进行优化（表1）[15]。2019年，Yamato等开发了单交叉介导的同源重组编辑策略，即转化载体中包含1个在CRISPR/Cas9切割位点的单同源臂，高效实现了稻瘟菌中SDH的替换与GFP基因的敲入，并且利用该策略验证了Spo11基因的功能和表达[16]。

2.2 橡胶树胶孢炭疽菌

橡胶树胶孢炭疽菌可侵染橡胶树苗期、幼树直至成熟阶段，严重影响胶乳产量[17]。在广东红五月农场、海南琼海和琼山橡胶林等地曾大面积暴发[18]。郭燕华等对该菌建立了的CRISPR/Cas9系统，通过ChopChop[19]软件预测靶标基因URA5中的sgRNA切割点，再将体外表达出含Cas9的RNP与sgRNA融合成复合体转化至该菌中，结果在HDR与NHEJ条件下均成功获得了敲除突变株ΔURA5，表现为尿嘧啶缺陷[20]，其中HDR相比NHEJ能够在基因编辑过程中实现双突变[21]，应用场景更广阔。2019年，Nakamura等首次利用3种CRISPR/Cas9系统对炭疽菌的SCD1进行了基因替换，首先利用质粒转化的方式，效率高达97.1%;其次利用Cas9/sgRNA复合物转化，效率达到82.1%;最后同时利用Cas9和sgRNA表达质粒进行杂交转化，效率为89.2%，此外还用该方式对NIS1、Cel5A、g9136、MC96基因进行了编辑，除MC96效率仅有50%外，其余均达到理想效率，并且验证了该杂交转化体系可减少脱靶与DNA损伤反应现象[22]。

2.3 玉米黑粉菌

玉米黑粉菌引起谷物黑穗病，在我国黄淮海周边、东北地区发病现象普遍[23]。Schuster等利用CRISPR/Cas9技术靶向了该菌中的bE1和bW2基因，在Cas9中添加了2个NLS和HA标签以组成NLS-Cas9-HA-NLS复合物，并将其置于具有萎锈灵抗性的质粒pMS7中，在不添加DNA供体的情况下将pMS7转化至该菌，通过菌株的Fuz表型（是否为菌丝体）评估，结果获得的突变株在单个转化子的子代中高达70%～100%，2个目标基因的编辑效率差异较大。最后在缺乏萎锈灵的培养基中筛选，具萎锈灵抗性的转化子可以将pMS7丢弃，解决了单个突变体后代多异质的问题[24]。2019年，Huck等成功构建了靶向稗黑粉菌malA基因（编码苹果酸酶）的CRISPR/Cas9系统，利用短DNA修复模板在Cas9剪切靶标序列后诱导HDR的基础上对目标基因进行特殊的修饰，该方法为后续构建基于NHEJ且无标记的高效突变体系奠定了基础[25]。2021年，Wege等基于CRISPR/Cas9技术并利用高浓缩的短双链寡核苷酸诱导HDR成功靶向了玉米黑粉菌中编码细胞分裂所需的don3基因，包括敲除、替换、基因组位点异源互补以及内源性荧光蛋白标记等试验，弥补了玉米黑粉菌需要長同源序列才能产生基因缺失的局限性[26]。

2.4 链格孢霉

链格孢霉可引起果树、蔬菜等植物病害[30]。Wenderoth等通过改造构巢曲霉的CRISPR系统，靶向了链格孢霉黑色素合成过程中聚酮化合物合酶基因pksA和1，3，8-THN还原酶基因brm2，在sgRNA两端分别安装了不同的核酶，通过原生质体介导的方式将质粒导入该菌，结果有1/10概率表现出缺乏黑色素的表型，为了产生稳定突变株，再以单孢子菌落在不同培养基上多次再生纯化，从而使得转化质粒丢失，体现出了该方式可连续诱变靶基因以及在无选择压力情况下自我复制质粒可丢失的优势，有利于无性物种进行遗传育种。此外，首次在该菌的基因编辑中引入绿色荧光蛋白（GFP），将GFP的C端添加NLS以保证其特异性，结果显示14个尿嘧啶转化子中有9个表型发光，证实了GFP利用的可行性[27，31]。2019年，他们再次利用CRISPR技术致使该菌中多个合成基因失活，并在米曲霉中外源表达来自链格孢霉的聚酮化合物（AOH）及其衍生物单甲醚（AME）基因，鉴定了AOH与AME的合成基因簇pksl，并进一步通过pksl基因簇的缺失突变体毒力降低现象验证了AOH与AME是链格孢霉的毒力因子之一[32]。

2.5 小球腔菌

小球腔菌可使十字花科植物患上黑胫病，造成产量、品质下降[33]。Idnurm等针对小球腔菌设计CRISPR/Cas9系统进行了2次尝试。第1次成功靶向了hos1基因（编码组氨酸激酶），先后转化sgRNA、Cas9至该菌，最后利用KpnⅠ限制酶测序，结果显示小球腔菌在hos1基因区域均有突变，但通过接种发现其致病性依然存在。第2次成功靶向了AvrLm1无毒基因，将一个HDV核酶绑定于sgRNA，另一个锤头状核酶与sgRNA的折叠区域被合成为含有101个核苷酸的寡核苷酸，减小了构建体大小以便转化，结果除了目标位点的突变外，其等位基因还发生额外的碱基对缺失[28]。2020年，Zou等利用CRISPR/Cas9系统对该菌中AvrLm1进行突变，在无抗性选择标记的情况下鉴定其编辑效率在单个转化子的子代中达到32%，该基因突变导致H2O2产生不同水平积累，从而对具有相应抗性基因Rlm7的甘蓝型油菜表现出不同毒力效果，进一步利用突变株毒性进行抗性测定，将得到的具抗株用以选育或鉴定甘蓝型油菜中新型Rlm7[34]。Darma等首次鉴定出该菌中包含类脱落酸合成基因簇pks5，并基于CRISPR/Cas9技术对该基因进行毒性测定，其中2个基因与其对油菜子叶的致病性无直接关联[35]。

2.6 镰刀菌

镰刀菌可引起小麦、玉米、水稻等经济植物患病，是全球最常见的植物病原真菌之一[36]。Ferrara等基于CRISPR/Cas9工具，对该菌中FUM1基因进行编辑，利用微同源重组的方式，即发生在目标位点相邻序列的两侧同源50 bp内的HDR，极大地降低了突变邻近基因的风险并且具有能靶向紧密间隔基因的优点，与常规重组相比，进一步增加了靶向精确性，同时也能降低脱靶风险。结果获得了11个ΔFUM1转化子，并且在表型都没有产生明显变化的前提下，转化子均未检测出伏马菌素。该研究首次使用CRISPR/Cas9系统删除了霉菌毒素合成途径中的pks基因，并证实该系统可用于靶向其近亲物种藤仓镰孢菌等[29]。Wang等针对尖孢镰刀菌体于外组装了包含Cas9、sgRNA的RNP复合体并转入其原生质体，进行PEG（细胞融合剂）介导的基因编辑，成功突变了该菌次级代谢产物合成基因簇中聚酮合酶的BIK1同源基因，虽然效率仅有50%，但证实了该基因参与红色素比卡菌素的合成[37]。2019年，该团队基于独立的同源靶向整合（HITI）和非独立的同源重组整合（HDRI）开发了由CRISPR/Cas9介导的内源性基因标记系统（EGT），分别通过这2种方式标记了尖孢镰刀菌FoCHS5、FoSSO1基因的C′端以及FoSSO2的N′端，并利用该标记系统判断这3类基因在该菌生长发育过程中的表达位置及强弱，以此促进调控因子或毒力因子的研究[38]。

3 存在的问题

3.1 基因编辑效率低是影响CRISPR/Cas9系统进一步推广的重要原因

随着CRISPR/Cas9基因编辑技术在植物病原真菌中应用的进一步探究，其局限性也逐步展现出来。首先便是编辑效率普遍不高，目前主要是利用该方式探索靶标基因的功能，从而挖掘其分子层面的致病机理。效率低下表现为突变个体较少，并且在遗传至下一代时会出现基因逐渐复原的现象，这使得无法短时间内将有益基因广泛传播。虽然可以尝试改善试验方案来缓解，但是也产生了未知因素，譬如上述应用于稻瘟菌的共同编辑策略虽然减少了脱靶，却也导致突变降低[15]。效率低下还表现为易产生意外突变，这使得编辑的不稳定性大大增加，譬如上述应用于胶孢炭疽菌和小球腔菌时多余的序列插入带来的两面性[20，28]，额外突变产生的未知影响还有待考证，其次是否也可以利用该影响设计出定向的双突变还不得知。效率低下还可以表现为脱靶率较高，即sgRNA对目标基因特异识别能力较弱，譬如上述应用于玉米黑粉菌时由于使用混合的破壁酶制备原生质体增加了脱靶[24]。在这些因素有效解决之前很难将该基因编辑方式的应用进一步扩大。

3.2 SgRNA设计工具是影响结果准确性的原因

SgRNA是CRISPR/Cas9系统的核心构件，它设计的质量将直接影响编辑效率和靶向特异性。由表1可以看出，sgRNA设计工具不尽相同，由于不同工具所基于的数据和算法不同，甚至设计的侧重点不同，譬如激活、敲除等，这些因素都会影响sgRNA相对质量。当前sgRNA设计工具的权威性也没有统一标准，较好的诸如GPP Web Portal[39]、CHOPCHOP[19]、E-CRISP[40]等软件。虽然这些工具都具有相对不错的反响，但是归根结底都是计算机模型预测的结果，难免会出现与实际相违背的情况。目前sgRNA设计工具更多的作用是简化了试验程序，对结果的影响还需要进一步验证。

3.3 突变检验方式是影响结果准确性的原因

突变检验是对编辑结果进行验证的必要环节，通过表1可以看出，不同病原真菌的检验方式不尽相同。宏观上可利用表型变化、抗性变化等进行筛选，进而将不符合预期表型或抗性的个体作为非突变体剔除。由于基因在被编辑的过程中稳定性无法料知，一方面可能发生sgRNA特异性偏失进而造成非目标位點意外突变或者细胞在生长过程中由于某些因素造成目标突变基因未能正常表达等;另一方面在已确认为正确突变的个体中可能存在由基因漂移导致的突变，即非基因编辑直接导致的变化等，这些因素都会造成宏观检验上对编辑效率认知的偏差。相比之下，分子水平上的检验更为严谨，即对基因测序验证其结果。尽管该方式较繁琐，或许可以利用统计学知识随机取样进而估算出效率。

4 展望

4.1 进一步扩大探索CRISPR/Cas9系统应用于植物病原真菌的范围是未来研究的重点

CRISPR/Cas9系统目前虽然已经取得了很多研究成果，但其在应用中的用途仍处于初期。当前相关报道多数只是为了对目标位点尝试能否实现单一突变，对病原真菌应用的范围仍有很大的提升空间，诸如细胞转录的激活与抑制、基因组成像等。此外，目前将该系统应用于病原真菌的种类较少，多数相关报道局限于稻瘟病菌、玉米黑粉菌、镰刀菌等。在十大植物病原真菌中，灰葡萄菌、小麦条形柄锈菌等目前被CRISPR/Cas9系统应用的相关研究报道较少，未来还有很大的发展空间[41-42]。

4.2 进一步提高CRISPR/Cas9系统的编辑效率是未来研究的热点

基因编辑效率不高一直是相关研究的壁垒。目前主要通过改善试验细节来解决，譬如上述稻瘟菌的共同编辑策略[15]、炭疽菌的杂交转化体系[22]、镰刀菌的体外组装RNP直接转化原生质体方式都表现出了相对较优异的抗脱靶性，应用于镰刀菌的微同源重组编辑方式同时表现出了高效率与抗脱靶性2个优点[29];此外，Matsuura等研究发现，在适当的范围内，Cas9和sgRNA的浓度与编辑效率成正比[43];也有研究显示在非靶序列的种子区域最好要安排不低于3个连续错误配对组成[44];以sgRNA设计逻辑为核心更改其细节，例如嵌合sgRNA法，可以进一步降低脱靶[45]。尽管这些方案能否广泛运用还有待验证，但都为提高CRISPR/Cas9系统的编辑效率奠定了基础。

4.3 进一步探索适合真菌特性的新型基因编辑技术是未来研究的难点

整体上看，当前主要能够改善基因编辑的方法集中在sgRNA的特异性、启动子的合理选择、Cas9的修饰以及转化方式的改良等。如何使得该技术能够顺利对目标基因高效修改并尽可能降低不良影响是目前需要完善和突破的地方。随着对植物病原真菌致病基因探究的进展，更多潜在的编辑方式会被发现与优化，将为植物病原真菌致病功能基因挖掘、定向遗传育种、RNA的转录调控以及对特定基因组实施表观遗传学修饰等方面提供重要研究意义。

参考文献：

[1]王福军，赵开军. 基因组编辑技术应用于作物遗传改良的进展与挑战[J]. 中国农业科学，2018，51（1）：1-16.

[2]张佳珊，谭 韬. CRISPR-Cas9系统编辑DNA诱导基因敲除的发展及优缺点[J]. 中国免疫学杂志，2019，35（6）：767-770.

[3]李宇恒，邓诚思，关爱伟，等. 利用CRISPR/Cas9技术建立PTEN敲除的人子宫内膜腺癌细胞模型及其功能研究[J]. 中国医科大学学报，2020，49（7）：582-585.

[4]张道微，张超凡，董 芳，等. CRISPR/Cas9系统在培育抗病毒植物新种质中的应用[J]. 遗传，2016，38（9）：811-820.

[5]Zhang S J，Guo F，Yan W，et al. Recent advances of CRISPR/Cas9-based genetic engineering and transcriptional regulation in industrial biology[J]. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology，2020，7：459.

[6]Jinek M，Chylinski K，Fonfara I，et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity[J]. Science，2012，337（6096）：816-821.

[7]Doudna J A，Charpentier E. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9[J]. Science，2014，346（6213）：1258096.

[8]李红花，刘 钢. CRISPR/Cas9在丝状真菌基因组编辑中的应用[J]. 遗传，2017，39（5）：355-367.

[9]Horvath P，Barrangou R. CRISPR/Cas，the immune system of bacteria and archaea[J]. Science，2010，327（5962）：167-170.

[10]Dance A. Core Concept：CRISPR gene editing[J]. PNAS，2015，112（20）：6245-6246.

[11]栗曉飞，曹英秀，宋 浩. CRISPR/Cas9系统研究进展[J]. 中国生物工程杂志，2017，37（10）：86-92.

[12]李亚男. 高海拔土壤中稻瘟病拮抗细菌的筛选及其抗菌机理研究[D]. 绵阳：西南科技大学，2017：1-2.

[13]Arazoe T，Miyoshi K，Yamato T，et al. Tailor-made CRISPR/Cas system for highly efficient targeted gene replacement in the rice blast fungus[J]. Biotechnology and Bioengineering，2015，112（12）：2543-2549.

[14]Jacobs J Z，Ciccaglione K M，Tournier V，et al. Implementation of the CRISPR-Cas9 system in fission yeast[J]. Nature Communications，2014，5：5344.

[15]Foster A J，Martin-Urdiroz M，Yan X，et al. CRISPR-Cas9 ribonucleoprotein-mediated co-editing and counterselection in the rice blast fungus[J]. Scientific Reports，2018，8：14355.

[16]Yamato T，Handa A，Arazoe T，et al. Single crossover-mediated targeted nucleotide substitution and knock-in strategies with CRISPR/Cas9 system in the rice blast fungus[J]. Scientific Reports，2019，9：7427.

[17]林春花，孙董董，韩 丹，等. 中国橡胶树苗圃2种炭疽病菌分子鉴定及分布分析[J]. 热带作物学报，2014，35（9）：1802-1808.

[18]蔡志英，黄贵修. 巴西橡胶树炭疽病研究进展[J]. 西南林业大学学报，2011，31（1）：89-93.

[19]Montague T G，Cruz J M，Gagnon J A，et al. CHOPCHOP：a CRISPR/Cas9 and TALEN web tool for genome editing[J]. Nucleic Acids Research，2014，42（W1）：W401-W407.

[20]郭燕华，安 邦. 基于CRISPR-Cas9技术构建橡胶树胶孢炭疽菌的基因敲除系统[J]. 微生物学通报，2020，47（1）：109-117.

[21]Zhang C，Meng X H，Wei X L，et al. Highly efficient CRISPR mutagenesis by microhomology-mediated end joining in Aspergillus fumigatus[J]. Fungal Genetics and Biology，2016，86：47-57.

[22]Nakamura M，Okamura Y，Iwai H. Plasmid-based and-free methods using CRISPR/Cas9 system for replacement of targeted genes in Colletotrichum sansevieriae[J]. Scientific Reports，2019，9：18947.

[23]梁 爽. 玉米抗瘤黑粉病QTL定位[D]. 沈阳：沈阳农业大学，2018：5-6.

[24]Schuster M，Schweizer G，Reissmann S，et al. Genome editing in Ustilago maydis using the CRISPR-Cas system[J]. Fungal Genetics and Biology，2016，89：3-9.

[25]Huck S，Bock J，Girardello J，et al. Marker-free genome editing in Ustilago trichophora with the CRISPR-Cas9 technology[J]. RNA Biology，2019，16（4）：397-403.

[26]Wege S M，Gejer K，Becker F，et al. Versatile CRISPR/Cas9 systems for genome editing in Ustilago maydis[J]. Journal of Fungi，2021，7（2）：149.

[27]Wenderoth M，Pinecker C，Vo B，et al. Establishment of CRISPR/Cas9 in Alternaria alternata[J]. Fungal Genetics and Biology，2017，101：55-60.

[28]Idnurm A，Urquhart A S，Vummadi D R，et al. Spontaneous and CRISPR/Cas9-induced mutation of the osmosensor histidine kinase of the canola pathogen Leptosphaeria maculans[J]. Fungal Biology and Biotechnology，2017，4：12.

[29]Ferrara M，Haidukowski M，Logrieco A F，et al. A CRISPR-Cas9 system for genome editing of Fusarium proliferatum[J]. Scientific Reports，2019，9：19836.

[30]蔣黎艳. 柑橘中5种链格孢霉毒素检测技术及产生分布规律初探[D]. 重庆：西南大学，2016：15-17.

[31]N dvig C S，Nielsen J B，Kogle M E，et al. A CRISPR-Cas9 system for genetic engineering of filamentous fungi[J]. PLoS One，2015，10（7）：e0133085.

[32]Wenderoth M，Garganese F，Schmidt-Heydt M，et al. Alternariol as virulence and colonization factor of Alternaria alternata during plant infection[J]. Molecular Microbiology，2019，112（1）：131-146.

[33]张佳星，李 玲，戴德江，等. 白术枯斑病原鉴定、生物学特性及其对不同药剂的敏感性研究[J]. 植物病理学报，2018，48（5）：682-692.

[34]Zou Z W，Liu F，Selin C，et al. Generation and characterization of a virulent Leptosphaeria maculans isolate carrying a mutated AvrLm7 gene using the CRISPR/Cas9 system[J]. Frontiers in Microbiology，2020，11：1969.

[35]Darma R，Lutz A，Elliott C E，et al. Identification of a gene cluster for the synthesis of the plant hormone abscisic acid in the plant pathogen Leptosphaeria maculans[J]. Fungal Genetics and Biology，2019，130：62-71.

[36]孙 丽. 南大西洋深海沉积物源可培养细菌的鉴定及抑真菌活性[D]. 哈尔滨：哈尔滨工业大学，2014：2-3.

[37]Wang Q，Cobine P A，Coleman J J. Efficient genome editing in Fusarium oxysporum based on CRISPR/Cas9 ribonucleoprotein complexes[J]. Fungal Genetics and Biology，2018，117：21-29.

[38]Wang Q，Coleman J J.CRISPR/Cas9-mediated endogenous gene tagging in Fusarium oxysporum[J]. Fungal Genetics and Biology，2019，126：17-24.

[39]Erard N，Knott S R V，Hannon G J. A CRISPR resource for individual，combinatorial，or multiplexed gene knockout[J]. Molecular Cell，2017，67（2）：348-354.e4.

[40]Heigwer F，Kerr G，Boutros M.E-CRISP：fast CRISPR target site identification[J]. Nature Methods，2014，11（2）：122-123.

[41]Dean R，van Kan J A L，Pretorius Z A，et al. The Top 10 fungal pathogens in molecular plant pathology[J]. Molecular Plant Pathology，2012，13（4）：414-430.

[42]范德佳，陈士强，王建华，等. 利用CRISPR/Cas技术改良作物抗病性的研究进展[J]. 江苏农业学报，2020，36（5）：1312-1321.

[43]Matsu-Ura T，Baek M，Kwon J，et al. Efficient gene editing in Neurospora crassa with CRISPR technology[J]. Fungal Biology and Biotechnology，2015，2：4.

[44]张 晨，雷 展，李 凯，等. CRISPR/Cas9系统中的脱靶效应及检测技术研究进展[J]. 生物技术通报，2020，36（3）：78-87.

[45]Yin H，Song C Q，Suresh S，et al. Partial DNA-guided Cas9 enables genome editing with reduced off-target activity[J]. Nature Chemical Biology，2018，14（3）：311-316.