基于网络药理学探讨胆宁片治疗慢性胆囊炎的活性成分及其分子作用机制Δ

杨 提，王 雪，杨云云，丁 楠，王学彬,4#，陈井霞#

(1.上海市浦东新区公利医院药剂科，上海200135； 2.海军军医大学第一附属医院药剂科，上海 200433； 3.沈阳药科大学生命科学与生物制药学院，沈阳 110016； 4.复旦大学药学院生物药物系，上海 201203)

慢性胆囊炎一般是由长期存在的胆囊结石或急性胆囊炎反复发作迁延不愈导致的胆囊慢性炎症。根据胆囊内是否存在结石，分为结石性胆囊炎和非结石性胆囊炎。目前，慢性胆囊炎以西药及手术治疗等为主，但结石残余率、复发率高，手术并发症及再手术的发生风险较高。有研究结果表明，中药治疗慢性胆囊炎的临床效果显著且远期疗效可观[1]。中药胆宁片的主要成分为大黄、虎杖、青皮和山楂等7味中药，具有消炎利胆、防石护肝、清热通下之功效，对于慢性胆囊炎具有较好的治疗效果，是为数不多的具有防石溶石作用的纯中药制剂。虽然胆宁片在治疗慢性胆囊炎和预防胆固醇结石形成中有一定的疗效，但其作用靶点仍不明确[2]。网络药理学分析是在系统生物学与多向药理学的基础上提出的新思想、新策略，能够系统综合地观察药物对疾病网络的干预和影响，尤其适用于“多成分-多靶点-多通路”的中药药理学研究[3]。本研究通过网络药理学方法，探讨胆宁片治疗慢性胆囊炎的药物作用靶点，为胆宁片后续药理作用研究提供基础理论。

1 资料与方法

1.1 胆宁片活性成分及潜在靶点获取

胆宁片由大黄、虎杖、青皮、陈皮、郁金、山楂和白茅根等7味中药组成，通过中药系统药理学数据库与分析平台(TCMSP)(http://lsp.nwu.edu.cn/tcmspsearch.php)和草本组鉴数据库(HERB)(http://herb.ac.cn/)检索中药胆宁片的化学组分。口服生物利用度(OB)指化合物在给药后，吸收进入血液循环系统的相对量，是决定化合物是否具有分子类药性的关键指标；类药性(DL)反映化合物的结构特征及理化性质，可用于评估生物分子作为药物的可能性。因此，根据网络药理学系统特点，以OB≥30%且DL≥0.18为条件，筛选具有生物活性的化合物及其作用的蛋白质靶点，并导入Uniprot蛋白质数据库(http://www.uniprot.org)得到标准化的蛋白质靶点信息。

1.2 慢性胆囊炎相关靶点的获取

以“gallbladder”和“chronic cholecystitis”为关键词，分别在GeneCards数据库(http://www.GeneCards.org)、DisGeNET数据库(http://www.disgenet.org/)及Drugbank数据库(https://go.drugbank.com/)中检索，得到慢性胆囊炎相关靶点。在GeneCards数据库中，Score值越高，靶点与疾病之间的关联越密切，以相关性分值≥5分作为筛选条件，对检索到的慢性胆囊炎靶点进行重整，再合并检索结果去重后，最终获得慢性胆囊炎相关靶点。

1.3 胆宁片作用于慢性胆囊炎相关靶点的预测

利用Venny 2.1绘制胆宁片-慢性胆囊炎靶点韦恩图，得到药物-疾病共有靶点，即胆宁片治疗慢性胆囊炎的作用靶点。

1.4 胆宁片所含化合物与慢性胆囊炎相关靶点相互作用的网络构建

将每个化学成分与其作用的慢性胆囊炎靶点相联系，通过Cytoscape 3.7.2 软件构建胆宁片成分-慢性胆囊炎相关靶点相互作用网络并绘制网络图，利用软件中的内置工具包NetworkAnalyzer分析网络节点度和介数中心度。

1.5 胆宁片治疗慢性胆囊炎靶点蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)网络构建

将“1.3”项下所得共有靶点输入STRING平台(http://www.string-db.org/)，设定物种为“Homo sapiens”，最小互相作用阈值设定为“medium confidence”(>0.4)，其余设置均为默认设置，构建胆宁片-慢性胆囊炎靶点PPI网络图。再将PPI网路数据导入Cytoscape 3.7.2软件，通过Cytoscape 3.7.2内置工具包NetworkAnalyzer分析PPI网络拓扑学参数，并根据网络拓扑学参数筛选核心靶点，再利用R语言软件中count.R插件统计筛选出的核心靶点在PPI网络中的出现频次分布情况。

1.6 基因本体(GO)与京都基因与基因组百科全书(KEGG)富集分析

GO对基因和蛋白质功能进行限定和描述，将基因功能分为3个部分，即细胞组分(CC)、分子功能(MF)和生物过程(BP)[4]。KEGG是一个整合基因组、化学和系统功能信息的数据库[5]。应用R语言软件中Cluster Profiler GO.R插件及Perl语言对胆宁片活性成分及药物-疾病共有靶点进行GO分析和KEGG通路富集，对结果进行可视化分析，得到胆宁片治疗慢性胆囊炎的生物功能和信号通路。

1.7 胆宁片成分-慢性胆囊炎靶点-通路网络图的构建

运用Cytoscape 3.7.2构建胆宁片成分-慢性胆囊炎靶点-通路网络图，利用Cytoscape 3.7.2内置工具分析有效成分及靶点的网络拓扑参数，包括连接度、介度及紧密度等，并根据网络拓扑学参数判断核心靶点及发挥药效的主要活性成分。

2 结果

2.1 胆宁片的主要活性成分和潜在靶点

通过TCMSP数据库和HERB数据库对中药胆宁片大黄、虎杖、青皮、陈皮、郁金、山楂和白茅根分别进行检索，筛选OB≥30%且DL≥0.18的活性成分及相应的作用靶点，得到活性成分32种，潜在作用靶点251个。

2.2 慢性胆囊炎相关疾病靶点获取

通过GeneCards数据库、DisGeNET数据库及Drugbank数据库分别检索关键词“gallbladder”和“chronic cholecystitis”以获取疾病靶点，合并搜索结果后删除重复靶点，得到361个慢性胆囊炎相关靶点。

2.3 胆宁片活性成分与慢性胆囊炎的共有靶点

将上述筛选所得的胆宁片活性成分靶点与慢性胆囊炎相关靶点取交集，并通过Venny 2.1绘制韦恩图，得到胆宁片治疗慢性胆囊炎的作用靶点60个(见图1)及其对应的潜在活性化合物24种，根据共有靶点与活性化合物化合物可知所属中药名称，见表1。

图1 胆宁片活性成分-慢性胆囊炎靶点韦恩图Fig 1 Wayne diagram of active ingredients of Danning tablets-chronic cholecystitis targets

2.4 胆宁片靶点-慢性胆囊炎相互作用网络

将候选化学成分与慢性胆囊炎靶点通过Cytoscape 3.7.2软件构建胆宁片成分靶点-慢性胆囊炎靶点群网络，得出胆囊片靶点-慢性胆囊炎网络主要由84个节点(24个化合物节点，60个靶点节点)和257条边组成，其中三角形节点表示胆宁片药物活性成分，圆形节点表示胆宁片可能是通过这些基因治疗慢性胆囊炎，连接化合物与靶点的每条边表示胆宁片活性成分与慢性胆囊炎靶点之间的相互作用关系，见图2。在胆宁片靶点-慢性胆囊炎靶点网络中，胆宁片中有24种主要成分作用于慢性胆囊炎相关靶点，充分体现了其多成分、多靶点的作用特点。其主要的化合物有槲皮素(quercetin)、柚皮素(naringenin)、β-谷甾醇(beta-sitosterol)、川陈皮素(nobiletin)、木犀草素(luteolin)、芦荟大黄素(aloe-emodin)、毒扁豆次碱(physovenine)、橘皮素(tangeretin)和大黄酸(rhein)等，所属活性成分可能胆宁片是治疗慢性胆囊炎的物质基础。

图2 胆宁片活性成分-慢性胆囊炎靶点网络图Fig 2 Network diagram of active ingredients of Danning tablets-chronic cholecystitis targets

2.5 PPI网络构建

将药物-疾病共有靶点60个输入STRING平台得到胆宁片-慢性胆囊炎共有靶点PPI网络图(40个节点，455条边)，见图3。应用R语言count.R统计出现频率前15位的蛋白靶点，其中出现频率较高的有肿瘤蛋白p53(TP53)、白细胞介素6(IL-6)和血管内皮生长因子A(VEGFA)等，见图4。

图3 胆宁片与慢性胆囊炎共有靶点PPI网络图Fig 3 Network diagram of protein-protein interaction (PPI) of shared targets of Danning tablets and chronic cholecystitis

2.6 GO功能分析与KEGG富集分析结果

通过GO分析得到BP、CC和MF 3类，并根据信号通路中基因所占总体输入基因的比率进行排列，筛选出前15位，见图5(A—C)。如图5(A)所示，胆宁片治疗慢性胆囊炎主要涉及的BP为上皮细胞增殖(epithelial cell proliferation)、细胞的氧化应激反应(cellular response to oxidative stress)和细胞的化学应激反应(cellular response to chemical stress)等；如图5(B)所示，治疗的关键靶点主要作用于核膜(nuclear membrane)、囊腔(vesicle lumen)和顶端质膜(apical plasma membrane)等；如图5(C)所示，主要涉及的MF为受体配体活动(receptor ligand activity)、信号受体活动(signaling receptor activity)和生长因子受体结合(growth factor receptor binding)等。

根据通路基因所占总体输入基因的比率排序，展示排序居前20的信号通路，见图5(D)。胆宁片治疗慢性胆囊炎的作用靶点主涉及的信号通路主要包括膀胱癌(bladder cancer)、人巨细胞病毒感染(human cytomegalovirus infection)和磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B(PI3K-Akt)信号通路(PI3K-Akt signaling pathway)等，体现了胆宁片多成分、多靶点、多通路的作用特点，见表2。

2.7 胆宁片成分-慢性胆囊炎靶点-通路网络图的构建

运用Cytoscape 3.7.2构建胆宁片成分-慢性胆囊炎靶点-通路网络，见图6。运用Cytoscape 3.7.2内置的Network Analyzer分析胆宁片治疗慢性胆囊炎网络拓扑学参数，得到核心成分及核心作用靶点。结果表明，槲皮素(quercetin)连接度为32，介度为0.242 652，紧密度为0.652 174，预测槲皮素为胆宁片治疗慢性胆囊炎的主要成分；其次为木犀草素(luteolin)、川陈皮素(nobiletin)和芦荟大黄素(aloe-emodin)，见表3。TP53在网络中的连接度为22，介度为0.076 612，紧密度为0.571 429，预测TP53为胆宁片治疗慢性胆囊炎的最主要靶点；Cyclin依赖性激酶抑制剂1(CDKN1A)、G1/S-特异性Cyclin-D1(CCND1)、原癌基因丝氨酸/苏氨酸-蛋白激酶1(RAF1)、表皮生长因子受体(EGFR)、VEGFA、肿瘤坏死因子(TNF)、基质金属蛋白酶9(MMP9)、受体酪氨酸蛋白激酶2(ERBB2)和视网膜母细胞瘤相关蛋白1(RB1)亦为相对重要的靶点，见表4。

表3 胆宁片主要活性成分网络节点特征参数Tab 3 Characteristic parameters of network nodes of main active ingredients of cholinester tablets

表4 胆宁片主要活性成分靶点网络节点特征参数Tab 4 Characteristic parameters of targets network nodes of main active ingredients in Danning tablets

3 讨论

慢性胆囊炎最典型的症状为间歇性胆绞痛，是由胆囊结石阻塞胆囊管的反复发作所致，最终由于胆囊壁的增厚和硬化导致胆囊萎缩并丧失生理功能。我国缺乏全国性的慢性胆囊炎、胆石症流行病学资料。一项覆盖24个省市的针对体检人群的调查结果显示，我国不同年龄段人群胆囊结石的患病率为1.1%～11.2%，50岁以上中老年人为胆囊炎患病的主要人群[6]。慢性胆囊炎容易复发，为消化系统疾病中治疗费用较高的疾病。

胆宁片为临床治疗胆石症和胆囊炎的有效中药制剂，具有调节胆汁成分、抑制胆石结石的作用。研究结果表明，胆宁片可能通过促进胆汁酸、卵磷脂的分泌，降低胆汁黏稠度，减少胆汁中胆固醇的含量[7]；同时，可降低胆汁中游离胆红素的含量，从而防止胆色素结石的形成及增大[8]。

根据Cytoscape网络分析胆宁片成分与疾病靶点-通路网络图，结果表明，槲皮素、木犀草素、川陈皮素和芦荟大黄素为胆宁片治疗慢性胆囊炎的主要成分，其中槲皮素可能是最主要的有效成分。槲皮素是自然界中广泛存在的多醇羟基黄酮类化合物，具有抗恶性肿瘤、抗氧化、抗炎、抗血栓、抗病毒、心血管保护和免疫调节等多种药理学活性[9]。慢性胆囊炎多为慢性结石性胆囊炎，而胆固醇代谢异常引起的胆囊胆固醇结石是引起慢性胆囊炎的主要病因，槲皮素可以通过促进胆固醇向胆汁酸的转化，促进体内胆固醇外排，抑制胆固醇合成的限速酶HMG-CoA还原酶的表达，进而降低总胆固醇及胆固醇酯含量[10-11]。

通过构建胆宁片与慢性胆囊炎的共有靶点PPI网络，以及胆宁片成分-慢性胆囊炎靶点-通路网络，对结果进行分析，得到胆宁片治疗慢性胆囊炎的最主要靶点为TP53，其次为CDKN1A、CCND1、RAF1、EGFR、VEGFA、TNF、MMP9、ERBB2和RB1等。TP53基因表达异常与恶性肿瘤的发生密切相关，TP53能结合并激活细胞分裂制动基因，从而抑制细胞的增殖和分化。研究结果表明，少数慢性胆囊炎壁肥厚伴重度异型上皮增生病例表现出TP53基因阳性[12]。在慢性胆囊炎中，TP53基因的转化突变可能与胆囊癌的发生密切相关[13]。细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂1A(CDKN1A)能够在G1期调节细胞周期的功能，该基因的表达受到TP53的严格控制[14]；并且，TP53参与包括鳞状细胞癌、乳腺癌和膀胱癌等多种肿瘤的病理生理过程[15]。然而，CDKN1A在慢性胆囊炎病理生理学过程中的作用还未见报道。

A.GO-BP功能富集；B.GO-CC功能富集；C.GO-MF功能富集；D.KEGG通路富集A.GO-BP function enrichmen; B.GO-CC function enrichment; C.GO-MF function enrichment; D.KEGG pathway enrichment图5 胆宁片治疗慢性胆囊炎潜在靶点的GO功能富集和KEGG通路富集分析气泡图Fig 5 Bubble diagram of GO function enrichment and KEGG pathway enrichment analysis of potential targets of Danning tablets in the treatment of chronic cholecystitis

本研究根据GO和KEGG富集分析结果，可以得出胆宁片在慢性胆囊炎治疗中参与的生物过程和信号通路。其中主要涉及的生物过程包括上皮细胞增殖、细胞的氧化应激反应和细胞的化学应激反应等；主要参与的信号通路包括膀胱癌信号通路、人巨细胞病毒感染信号通路和PI3K-Akt信号通路等，涉及CCND1、CDKN1A、EGFR、MYC、TP53和IL-6等靶基因，以上通路与细胞的生长、增殖和分化等密切相关[16]。IL-6是由184个氨基酸组成的多功能糖蛋白，在慢性胆囊炎患者的胆汁和血清中呈高表达状态，其作为一种炎症细胞因子，反映了机体对炎症及感染的反应状态[17-18]。胆囊局部的炎症反应是胆囊炎发病的重要基础，有效控制炎症对治疗胆囊炎具有明显的促进作用。EGFR在胆囊癌组织中的阳性表达率为70.7%，在胆囊不典型增生组织中的阳性表达率为85.7%，而在正常胆囊组织中没有阳性表达，推测EGFR与慢性胆囊炎和胆囊癌的发生可能有密切关系[19]。

综上所述，通过网络药理学研究方法，得到胆宁片治疗慢性胆囊炎可能与抗炎、调节胆固醇代谢相关。目前仅通过网络药理学对胆宁片参与治疗慢性胆囊炎的主要靶点、生物过程和重要信号通路进行探讨，为进一步阐明胆宁片治疗慢性胆囊炎的作用机制提供了理论基础。但是，基于网络药理学方法自身的局限性以及药方中各味中药材组分在煎煮过程中发生化学反应的复杂性，本研究并未将胆宁片原有的活性成分经过体内代谢后仍具有活性的代谢物纳入分析。本研究主要是以生物信息学技术分析结果为基础，后续将在此分析结果的基础上进一步筛选并在动物或细胞水平进行实验验证，进而明确胆宁片调控慢性胆囊炎的主要靶点。