芍药苷通过抑制Notch-1 信号通路影响肝癌细胞增殖、侵袭和凋亡的机制研究

夏 亮 谢齐贵 陈湛蕾

肝癌是最常发生的恶性肿瘤之一[1]。尽管肝癌的治疗手段不断发展，包括手术切除、移植、消融、经动脉化学栓塞等，但疗效仍不令人满意[2]。芍药苷是从白芍根中分离出来的一种生物活性成分，具有免疫调节、降血糖和降压等作用[3-4]。已有研究发现，芍药苷在多种人类癌症中具有抗肿瘤功能，例如肺癌、乳腺癌、肝癌等[5-7]。然而，芍药苷介导的抗肝肿瘤机制尚未完全明确。因此，本研究拟利用肝癌HepG2 细胞系，研究芍药苷对肝癌细胞增殖、侵袭、凋亡的影响及其潜在机制，报道如下。

1 实验材料

1.1 材料 人肝癌细胞HepG2（上海富衡生物科技有限公司，货号FH0076）。

1.2 药物及试剂 芍药苷（麦克林，批号C10081578）；DMEM 培养基（美国Gibco 公司，批号11965092）；EDTA-胰蛋白酶消化液（美国Gibco 公司，批号25200072）；胎牛血清（美国Gibco 公司，批号12483020）、磷酸盐缓冲盐水（PBS）（碧云天生物技术研究所，批号C0221A）；青霉素-链霉素溶液（美国Gibco 公司，批号15070063）；CCK-8 试剂盒（日本Dojindo 公司，批号CK-04）；transwell 小室（美国Corning 公司，批号3422）；基质胶（美国BD 公司，批号P0873K）；TRIzol 试剂（美国Invitrogen 公司，批号IK5013）；PrimeScriptRT 试剂盒、SYBRPremix Ex Taq 试剂盒（日本Takara 公司，批号RR047A、RR0584）；膜联蛋白V/碘化丙锭（Annexin-V/PI）凋亡试剂盒（美国BD 公司，批号6301518）；RIPA 裂解液、磷酸酶抑制剂、封闭液、一抗稀释液、二抗稀释液、ECL 发光显影液、BCA 蛋白浓度测定试剂盒（碧云天生物技术研究所，批号P0013B、ST019、P0252、P0256、P0258、P0018FS、P0012S）；兔抗人Notch-1 单克隆抗体、鼠抗人Hes-1 单克隆抗体、鼠抗人β-肌动蛋白（英国Abcam 公司，批号ab52627、ab119776、ab8226）。

1.3 仪器 FACS Calibur 流式细胞仪（美国BD公司）；ELx800 酶标仪（美国BioTek Instuments 公司）；奥林巴斯AI09 倒置光学显微镜（日本奥林巴斯公司）；Pierce ECL 系统（美国通用公司）。

2 实验方法

2.1 细胞培养及分组 使用含10%的胎牛血清、1%双抗的DMEM 培养基培养人肝癌细胞HepG2，并将其置入37 ℃、5%CO2的增湿培养箱中培养。待细胞融合度达到80%～90%时传代以备后续实验使用。将HepG2 细胞分为四组，空白对照组仅使用正常培养液进行培养。根据既往发表相关文献[8-9]，确定芍药苷用药浓度范围，设置低、中、高剂量，组细胞培养液中加入芍药苷，分别使其药物浓度为25、50、75 μmol/L。

2.2 CCK-8 实验测定细胞增殖活性 将处于对数生长期的细胞，按照104个/孔的密度接种于96 孔板中，设置3 个重复，放回培养箱继续培养至次日。加入不同浓度芍药苷（0、25、50、75、100、150 μmol/L）培养24 h 后，每孔加入10 μL CCK-8，继续培养3 h，使用酶标仪检测450 nm 波长处的吸光度值（A）。

2.3 Transwell 实验检测细胞侵袭能力 将100 μL细胞悬液以5×103个/孔的密度接种于涂有基质胶的Transwell 上层小室中，在无血清的DMEM 培养基中孵育，下层小室加入600 μL 含有10%血清的DMEM培养基。24 h 后将细胞用甲醇固定15 min，并用2%结晶紫染色。用棉签移除小室膜上未迁移的细胞，使用倒置显微镜拍照，记录跨膜细胞数。

2.4 流式细胞仪检测细胞凋亡率 将处于对数生长期HepG2 细胞以3×104个/孔的密度接种于6 孔板中，按上述分组处理细胞24 h，后消化细胞，并用预冷的PBS 洗涤细胞3 次，以3 000 r/min 离心10 min，留取细胞沉淀，加入500 μL 结合缓冲液后，依次加入5 μL Annexin-V/FITC 染液和10 μL PI 染液，室温避光孵育15 min，立即进行流式细胞仪检测，记录各组凋亡情况。

2.5 Western blot 检测细胞表达蛋白水平 取对数生长期的HepG2 细胞以3×104个/孔的密度接种于6孔板中，次日按上述分组处理细胞24 h，加入RIPA裂解液裂解细胞，冰裂30 min 后，以12 000 g、4 ℃离心30 min 吸取上清，用BCA 法测定蛋白浓度。每组取20 μg 蛋白加入SDS-PAGE 凝胶孔道进行电泳，后转移至PVDF 膜上。使用封闭液室温封闭膜1 h，后使用TBST 洗膜3 次，加入对应一抗，置于4 ℃摇床孵育过夜。次日洗膜3 次，加入对应二抗室温孵育2 h，后用ECL 发光显影液在曝光系统中进行蛋白条带成像。使用ImageJ 软件进行蛋白条带灰度分析。

2.6 统计学方法 应用SPSS 22.0 统计软件统计分析数据。本研究中所有实验均独立重复3 次。符合正态分布的计量资料以均数±标准差（）表示。单一处理条件下，组间比较采用单因素方差分析，两组比较使用Student’s t 检验。P＜0.05 视为差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 芍药苷对HepG2 细胞增殖活性的影响 各组细胞培养24 h 后，与空白对照组细胞比较，随着芍药苷处理浓度增加，细胞增殖活性呈剂量依赖性显著降低（P＜0.05），见表1。

表1 各组肝癌HepG2 细胞OD 值、增殖活性比较（）

表1 各组肝癌HepG2 细胞OD 值、增殖活性比较（）

注：空白对照组给予芍药苷0 μmol/L；芍药苷25 μmol/L 组给予芍药苷25 μmol/L；芍药苷50 μmol/L 组给予芍药苷50 μmol/L；芍药苷75 μmol/L 组给予芍药苷75 μmol/L；芍药苷100 μmol/L 组给予芍药苷100 μmol/L；芍药苷150 μmol/L 组给予芍药苷150 μmol/L；与空白对照组比较，aP＜0.05；与芍药苷25 μmol/L 组比较，bP＜0.05；与芍药苷50 μmol/L 组比较，cP＜0.05；与芍药苷75 μmol/L 组比较，dP＜0.05；与芍药苷100 μmol/L 组比较，eP＜0.05

3.2 芍药苷对HepG2 细胞增侵袭能力的影响 与空白对照组比较，芍药苷低、中、高剂量组的细胞穿膜数显著减少（P＜0.05），且芍药苷低、中、高剂量组抑制细胞侵袭能力呈剂量依赖性（P＜0.05），见表2和图1。

表2 各组肝癌HepG2 细胞穿膜数目比较（个，）

表2 各组肝癌HepG2 细胞穿膜数目比较（个，）

注：空白对照组给予芍药苷0 μmol/L；芍药苷低剂量组给予芍药苷25 μmol/L；芍药苷中剂量组给予芍药苷50 μmol/L；芍药苷高剂量组给予芍药苷75 μmol/L；与空白对照组比较，aP＜0.05；与芍药苷低剂量组比较，bP＜0.05；与芍药苷中剂量组比较，cP＜0.05

图1 芍药苷对HepG2 细胞增侵袭能力的影响（2%结晶紫染色，×40）

3.3 芍药苷对HepG2 细胞凋亡反应的影响 Annexin-V/PI 双染法结果显示，与空白对照组比较，芍药苷处理组HepG2 细胞凋亡率显著增加（P 均＜0.05），且细胞凋亡率随芍药苷的处理浓度增加而升高（P＜0.05），见表3。

表3 各组肝癌HepG2 细胞凋亡率比较（%，）

表3 各组肝癌HepG2 细胞凋亡率比较（%，）

注：空白对照组给予芍药苷0 μmol/L；芍药苷低剂量组给予芍药苷25 μmol/L；芍药苷中剂量组给予芍药苷50 μmol/L；芍药苷高剂量组给予芍药苷75 μmol/L；与空白对照组比较，aP＜0.05；与芍药苷低剂量组比较，bP＜0.05；与芍药苷中剂量组比较，cP＜0.05

3.4 芍药苷对HepG2 细胞Notch-1 信号通路的影响 与空白对照组比较，芍药苷处理组Notch-1 及Hes-1 蛋白表达显著降低（P 均＜0.05），且随芍药苷处理浓度增加，蛋白表达逐渐降低（P 均＜0.05）。

4 讨论

目前，肝癌死亡的主要原因是肿瘤的复发和转移[10]。因此，抑制肝癌细胞侵袭、增殖具有重要意义。化疗药物为抑制肝癌转移的主要治疗手段，但其低特异性导致了众多不良反应和毒副作用[11]。与典型的化疗药物相比，药物植物有望成为更有效的治疗方法[12]。本研究结果表明，芍药苷可呈剂量依赖性降低肝癌细胞增殖活性。此外，在用芍药苷处理HepG2细胞24 h 后，随着芍药苷给药浓度的增加，细胞侵袭性逐渐降低，表明芍药苷成功地抑制了肝癌细胞的侵袭能力。Liu 等[7]发现，芍药苷可抑制HepG2 肝癌细胞的增殖、迁移和侵袭，与本研究结果一致。

表4 各组肝癌HepG2 细胞蛋白表达比较（）

表4 各组肝癌HepG2 细胞蛋白表达比较（）

注：空白对照组给予芍药苷0 μmol/L；芍药苷低剂量组给予芍药苷25 μmol/L；芍药苷中剂量组给予芍药苷50 μmol/L；芍药苷高剂量组给予芍药苷75 μmol/L；与空白对照组相比，aP＜0.05；与芍药苷低剂量组比较，bP＜0.05；与芍药苷中剂量组比较，cP＜0.05

Notch 信号通路是一种保守的信号转导通路，对细胞发育和凋亡非常重要[13-15]。在哺乳动物的四种Notch 受体中，Notch-1 是主要受体[16]。既往有研究证明，Notch-1 信号通路与肝癌的增殖、侵袭和转移有关[17-18]；因此，通过抑制该信号通路的活性有可能抑制肝癌细胞的上述功能。本研究观察了Notch 信号通路在芍药苷抑制肝癌细胞增殖、侵袭，并诱导凋亡中的潜在作用。我们发现，HepG2 细胞暴露于芍药苷24 h 后，参与Notch-1 信号通路的Notch-1 和Hes-1蛋白表达水平呈剂量依赖性显著降低。提示芍药苷可能通过抑制Notch-1 信号通路，从而抑制肝癌细胞的增殖、侵袭，并诱导凋亡。

综上所述，芍药苷显著抑制肝癌细胞HepG2 增殖和侵袭能力，还可诱导细胞发生凋亡，其机制可能与芍药苷抑制Notch-1/Hes-1 信号通路有关。