P4HA3 基因与结直肠癌进展及不良预后的相关性研究

方帅帅 袁马驰

结直肠癌（colorectal cancer，CRC）是全球发病率最高的恶性肿瘤之一，尤其在发达国家中的发病率始终居高不下[1]。在我国，由于缺乏早期检测，50%的CRC 患者确诊时已是中晚期，导致部分患者错失了最佳的根治机会[2]。研究表明，CRC 中的关键基因可作为其诊断、预防和治疗的分子标志物，并且能够揭示CRC 的发病机制[3]。脯氨酰4-羟化酶α-3（prolyl 4-hydroxylase alpha 3，P4HA3）基因在CRC中发挥重要作用，但具体作用机制尚不清楚。本研究运用生物信息学方法探究P4HA3 与CRC 的进展及预后的相关性，并通过免疫组化实验进行验证，旨在探讨P4HA3 基因在CRC 进展及不良预后中的作用，为CRC 治疗提供新的策略。

1 材料与方法

1.1 实验试剂 P4HA3（批号PA5-52483）和山羊抗兔IgG（批号A16116）购于美国Invitrogen 公司；阻断内源性过氧化物酶阻断剂（批号35000）购于美国Thermo Fisher Scientific 公司；石蜡（批号YA0012）、PBS 缓冲液（批号P1022）、抗原修复液（批号C1035）、DAB 显色（批号DA1010）和苏木素（批号H8070）购于北京Solarbio 公司。

1.2 数据来源 从The Cancer Genome Atlas（TCGA）数据库下载CRC 的基因数据和临床数据，含有647例CRC 患者肿瘤组织和51 例癌旁组织（距肿瘤组织5 cm 以上）。

1.3 P4HA3 基因表达数据的获取 应用R 软件BiocManager 及limma 提取P4HA3 表达数据，并提取P4HA3 在CRC 组织及其对应正常结直肠组织中的表达数据[4]。然后，利用R 软件对P4HA3 表达数据及配对数据进行可视化分析[5]。

1.4 P4HA3 基因与临床病理特征预后分析 卡方检验研究P4HA3 的表达与年龄、性别、Stage、T、N 和M 分期等CRC 临床特征的关联。

1.5 P4HA3 基因的生存分析 将P4HA3 基因表达及临床病理数据与患者生存数据整合，利用R 软件的survival 包进行生存分析，获得P4HA3 基因对患者生存状态的影响并作生存曲线进行可视化分析[6]。

1.6 P4HA3 基因表达与生存分析的验证 利用基因表达谱交互分析（gene expression profile interaction，GEPIA）数据库（http://gepia.cancer-pku.cn/index.html）对P4HA3 基因进行表达与生存分析。

1.7 P4HA3 基因的单基因富集分析 利用Perl 软件整理所需的P4HA3 基因表达数据集及表型数据，并采用基因集富集分析（gene set enrichment analysis，GSEA）软件（http://software.broad-institute.org/gsea）对P4HA3 基因进行京都基因与基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析。

1.8 免疫组化分析 收集2020 年6 月至2021 年6月杭州市第三人民医院病理科30 例CRC 患者手术切除肿瘤和癌旁组织蜡块样本进行回顾性分析，本研究经医院伦理委员会审核通过（伦理批号：2021KA040）。手工染色检测CRC 和癌旁组织中P4HA3 蛋白表达。经石蜡切片脱蜡水化、抗原修复、滴加阻断内源性过氧化物酶阻断剂、一抗P4HA3（1∶100）室温反应60 min、复温和二抗山羊抗兔IgG 室温反应20 min，最后DAB 显色、苏木素复染、脱水封片和显微镜观察。

2 结果

2.1 P4HA3 基因在CRC 中的表达 本文基于TCGA-CRC 数据对P4HA3 在CRC 中的表达进行分析发现，与51 例癌旁组织相比，P4HA3 在647 例CRC 组织中高表达（P＜0.01，见图1A）。其中，50 例的癌旁组织和肿瘤组织样本为配对样本。进一步对P4HA3 基因在配对的CRC 肿瘤组织及癌旁组织中的表达进行分析，结果显示，P4HA3 在CRC 组织高表达（P＜0.01，见图1B）。

图1 P4HA3 基因在结直肠癌中的表达

2.2 P4HA3 基因与临床病理相关性分析 去除临床数据不完整和生存时间小于30 d 的样本数据，剩余538 个CRC 组织样本，按P4HA3 在CRC 中表达中位数（0.47）分为高表达组和低表达组。不同临床特征与P4HA3 表达的关系见表1，结果显示，P4HA3表达与CRC 患者Stage 分期（χ2=9.970，P＜0.05）、T 分期（χ2=10.040，P＜0.05）和N 分期（χ2=15.270，P＜0.05）具有相关性，但与CRC 患者年龄、性别和M 分期无关（P＞0.05）。

2.3 P4HA3 基因生存分析 对P4HA3 基因进行生存分析，结果显示与P4HA3 低表达的CRC 患者相比，P4HA3 高表达的患者生存时间明显缩短（见图2），P4HA3 高表达与CRC 患者的不良预后相关（P＜0.05）。

2.4 P4HA3 基因的GEPIA 数据库验证 利用GEPIA 数据库检验P4HA3 基因在CRC 中的作用。与癌旁组织相比，P4HA3 基因在CRC 样本中高表达（见图3A）。P4HA3 基因与Stage 分期呈正相关（见图3B），并且P4HA3 与CRC 患者不良预后相关（P＜0.05，见图3C、D），与TCGA 数据库分析结果一致。

2.5 P4HA3 基因的KEGG 通路富集分析 利用GSEA 对P4HA3 进行KEGG 通路富集分析，结果见表2（FDR＜0.05），P4HA3 基因主要富集到MAPK 信号通路、TGF-β 信号通路、WNT 信号通路、TOLL 样受体信号通路、NOD 样受体信号通路、JAK-STAT 信号通路和VEGF 信号通路等，且这些信号通路与多种恶性肿瘤的发生发展有关。

表2 P4HA3 基因的KEGG 通路富集分析部分结果

2.6 P4HA3 基因的临床验证 本研究通过免疫组化对P4HA3 基因在CRC 组织中的表达进行临床验证。免疫组化结果显示，癌旁组织颜色较淡或几乎无染色；而CRC 肿瘤组织均大量分布且呈现黄色或棕褐色染色颗粒。颜色越深，P4HA3 蛋白表达越高。免疫组化典型图片见图4A 和B（分别为癌旁组织和肿瘤组织）。

图4 免疫组化检测P4HA3 蛋白（200×）

3 讨论

CRC 是常见的恶性肿瘤之一，其发病率逐年升高[7]。CRC 患者的治疗方式主要有手术、化疗和放疗等，但这些治疗方式对晚期患者疗效有限[8]。研究发现，分子标志物在CRC 患者的预后评估中可发挥关键作用[9]，有助于CRC 患者的诊断、预后和治疗[10]。

P4H 是维持胶原稳定性的必需酶，P4H 是一个α2β2 四聚体，其P4HA 是酶的底物结合结构域[11]。P4HA 的异常调节与一系列的病理过程有关，包括肿瘤的发生和发展[12]。P4HA 亚型包含P4HA1、P4HA2和P4HA3，而P4HA3 在正常组织中的表达非常低[13]。近年来，多项研究发现P4HA3 作为多种肿瘤的致癌基因，与肿瘤生长和生存期较差呈正相关[14]。然而，P4HA3 在CRC 中的作用尚未进行研究。因此，探讨P4HA3 基因在CRC 的进展及预后中的作用具有重要意义。

本研究发现，P4HA3 在CRC 肿瘤组织高表达，并且与CRC 患者的Stage、T 和N 分期显著相关，表明P4HA3 参与CRC 的发生发展。本研究通过生存分析发现，高表达P4HA3 的CRC 患者总生存时间明显缩短，这表明P4HA3 与CRC 的不良预后密切相关。KEGG 通路富集分析结果表明，P4HA3 基因主要富集到MAPK 信号通路、TGF-β 信号通路、WNT信号通路和JAK-STAT 信号通路等信号通路上。这些通路与多种恶性肿瘤的发生发展紧密相关，且P4HA3 可能通过激活这些信号通路进而参与调控CRC 进展。同时，有研究显示P4HA3 是一种胶原修饰酶基因，P4HA3 与乳腺癌预后及胃癌细胞转移有关[15-16]。P4HA3 在垂体腺瘤中表达上调，并且会促进垂体腺瘤细胞增殖、迁移和侵袭[17]。这些报道与我们的研究结果P4HA3 基因在CRC 患者中发挥重要作用具有一致性。

此外，本研究还通过免疫组化分析对P4HA3 在CRC 肿瘤组织和癌旁组织中的表达进行回顾性验证，发现P4HA3 在癌旁组织中低表达，而P4HA3 在CRC 组织中高表达。进一步验证了本研究生物信息学分析结果的真实性和准确性，揭示了P4HA3 基因在CRC 的进展及预后中的重要作用。

综上所述，本研究通过生物信息学和免疫组化分析验证了P4HA3 基因与CRC 的进展及不良预后显著相关。深入分析表明P4HA3 基因可作为CRC预后的分子标志物，有望成为CRC 患者新的治疗靶点，P4HA3 基因在CRC 中的作用机制值得深入探究。