小鼠骨髓来源巨噬细胞培养模型的建立及鉴定

马玲玲 ，马红梅 ，朱源鹤 ，宋孚洋 ，史客松 ，马臣杰 ，曾瑾

1.宁夏大学西部特色生物资源保护与利用教育部重点实验室，宁夏 银川 750021；2.宁夏大学生命科学学院，宁夏 银川 750021

巨噬细胞于1882年由俄罗斯动物学家ÉlieMetchnikoff 发现，从而开启了先天免疫主要防御机制的相关研究，该发现于1908年被授于诺贝尔生理医学奖［1］。巨噬细胞来源于血液单核细胞，单核细胞向组织迁移并分化，在整个组织中建立起防御病原体和体内平衡的功能，在机体的先天免疫系统和适应性免疫系统中均发挥重要作用，如抗原的加工及呈递、凋亡细胞及入侵病原体的清除，细胞因子的分泌等。均质的巨噬细胞群体在生命科学的相关研究中十分重要，因此，RAW264.7、J774A.1、THP-1、U937等传代的巨噬细胞样骨髓细胞系广泛应用于免疫学相关研究中。但这些细胞系由于连续传代培养所施加的选择性压力通常会导致一些基因的丢失，这些基因对于细胞的增殖并不重要，但对于巨噬细胞免疫功能却至关重要［2］，特别是使此类传代细胞难以体现原代巨噬细胞真实的细胞生理活动。

为了更好地研究巨噬细胞被病原体感染后的免疫应答反应，往往使用原代细胞系，而且生命科学研究中转基因小鼠和基因敲除小鼠的广泛应用，均迫切需要从这些动物中获得原代细胞进行培养。目前，原代小鼠巨噬细胞的3 个主要来源是腹腔巨噬细胞（peritoneal macrophage，PM）、肺泡巨噬细胞（alveolar macrophage，AM）和骨髓来源巨噬细胞（bone marrow-derived macrophage，BMDM）。腹腔巨噬细胞和肺泡巨噬细胞的获取相对容易，但产量低且巨噬细胞的生物学特性易受动物饲喂环境卫生条件的影响。BMDM 则是供体小鼠的骨髓干细胞在体外分化获得的，基本不受供体小鼠的健康状况影响，相对全面地保留基因表达谱且不受环境变化影响［3］。小鼠BMDM 是在巨噬细胞集落刺激因子（macrophage colony stimulating factor，M-CSF）或小鼠成纤维细胞系（L929）上清等存在下，对未分化的骨髓细胞进行体外分化获得的原代巨噬细胞，现已成为免疫学和细胞生物学重要的原代细胞模型。与许多其他原代细胞相比，小鼠BMDM 具有同质性、一定的增殖能力和超过1 周的寿命。有研究表明，小鼠BMDM 生长至第3 周尚未出现明显的死亡或形态改变［4］。该细胞易高产获得，可冷冻储存，也可从转基因小鼠身上获得，同时可从1 只小鼠中获取大量BMDM，从而满足平行实验的设置。因此，BMDM 所具有的优势使其在大多数免疫学研究中均倾向于选择该种细胞作为典型巨噬细胞模型。

目前，有很多研究者对BMDM 进行了研究。2015年，BARRETT 等［5］为了评估 BMDM 是否诱导了神经胶质细胞活化，将混合的神经胶质细胞培养物在条件培养基中进行孵育，其中条件培养基是从未刺激的小鼠和老年大鼠的BMDM 中获得的，并评估了炎症标记物的表达。2012年，MANZANERO［6］也用M-CSF 诱导骨髓原始细胞，成功制备了小鼠BMDM。2019年，LI 等［7］发现，在脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）刺激的 BMDM 中，MAPK、NF-kB 和 IRF3 通路均被激活。同年，OPPONG-NONTERAH 等［8］以 BMDM为巨噬细胞发育模型来测试早期炎症信号是如何影响细胞分化和功能的，发现TLR 的激活改变了BMDM 的分化。2013年，TROUPLIN 等［9］也用 L929细胞培养上清诱导小鼠骨髓细胞，7 d 时间成功制备了 BMDM，并通过 F4 ／ 80 和 HLA-DR 标记物及细胞吞噬实验证明小鼠骨髓细胞分化成巨噬细胞。2018年，曾立等［10］在BMDM 向破骨细胞分化特性的研究中，用M-CSF 诱导骨髓原始细胞，并用CD11b 抗体对BMDM 表面抗原进行鉴定，证实骨髓原始细胞经M-CSF 刺激后所得的细胞是BMDM。最近的一项研究中，研究者利用BMDM 及TLR4 敲除的BMDM细胞系对于一种分离自卵黄的称为“yolkin”的蛋白质进行研究，表明该蛋白可激活BMDM 细胞系产生包括TNF-α、Ⅰ型干扰素和NO 等先天性免疫介质，并证实“yolkin”蛋白是以TLR4 依赖性的方式激活巨噬细胞的。该研究为证实卵黄可用作先天免疫的有效免疫刺激剂或常规免疫缺陷疗法的补充剂提供了理论支持［11］。2019年，KIEFER 等［12］从血清类黏蛋白 1 样蛋白 3（orosomucoid-like 3，ORMDL3）过表达小鼠中获取BMDM，发现与野生型小鼠巨噬细胞相比，转基因小鼠模型BMDM 中的神经酰胺含量显著不同，但巨噬细胞的极化和吞噬能力未受ORMDL3表达水平的影响；该研究使用过表达的敲入小鼠模型BMDM 解决了ORMDL3 蛋白参与巨噬细胞生理的研究问题，为ORMDL3 表达与炎性疾病之间的功能联系提供了新的见解。上述研究均表明，BMDM的成功分离配合基因编辑小鼠的应用，在未来涉及免疫相关研究中的作用将越来越重要。

本研究旨在建立小鼠BMDM 培养模型，并进行鉴定，旨在为研究免疫细胞功能、病原微生物与巨噬细胞相互作用提供理想的细胞模型制备方法。

1 材料与方法

1.1 细胞及菌株 小鼠成纤维细胞NCTC clone 929（ATCC®CCL-1TM，L929）细胞系购自中国科学院细胞库 ／ 干细胞库；表达绿色荧光蛋白（GFP）的重组菌株 E.coli BL21（DE3）（pET30a-GFP）为作者构建并保存。

1.2 实验动物 SPF 级 C57BL-6J 小鼠，雌性，6 ~ 9周龄，体重18 ~ 20 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，实验动物生产许可证号：SCXK（京）2016-0006。本实验对小鼠的处理均以科研为目的进行养殖和使用，且按照动物伦理相关规定进行。

1.3 主要试剂 MEM 培养基、胎牛血清和DMEM培养基购自美国Gibco 公司；M-CSF 和FITC 标记的CD11b 抗体购自赛默飞世尔科技（中国）有限公司；小鼠M-CSF ELISA 试剂盒购自欣博盛生物科技有限公司。

1.4 L929 细胞的培养及培养上清中M-CSF 含量的检测 用含10%胎牛血清的MEM 基础培养基，于37 ℃，5% CO2条件下传代培养 L929 细胞，细胞生长状态良好时，传至173 mm2透气培养瓶中，加入含10%胎牛血清的DMEM 培养基，一组置于32 ℃，5%CO2培养箱中培养10 d，另一组置于37 ℃，5% CO2培养箱中培养3 d。取细胞培养上清，用0.22 μm滤器过滤去除细胞碎片，分装后于-80 ℃冻存备用。按照小鼠M-CSF ELISA 试剂盒说明书检测不同培养温度条件下L929 细胞上清中M-CSF 含量。

1.5 小鼠BMDM 的制备 乙醚麻醉处死小鼠，在75%乙醇中浸泡2 min 钟；用无菌手术剪剥除小鼠腿部皮肤，剪取小鼠股骨及胫骨，刮除骨上的肌肉及筋膜，用含2%青链霉素的磷酸盐缓冲液漂洗骨表面；剪除股骨及胫骨两端，吸取5 mL DMEM 培养基，将注射器针头插入股骨及胫骨骨髓腔，吹出骨髓，重复多次，直至股骨及胫骨无色，吹散后收集单细胞悬液，离心，弃上清；在离心细胞沉淀中加入3 mL 红细胞裂解液，迅速吹散细胞沉淀，20 s 后加入10 mL 含10 %胎牛血清的DMEM 完全培养基中和，离心弃上清；加入完全培养基，重悬细胞，接种至细菌培养皿中，置于37 ℃，5%CO2培养箱中培养4 h；轻轻摇动培养皿，吸取未贴壁细胞，离心弃上清，细胞沉淀重悬后，重新接种于含20 ng ／ mL M-CSF 或20% L929 细胞培养上清的完全培养基的细胞培养皿中，将培养皿置于37 ℃，5% CO2培养箱中培养，记为第1 天；第3 天时对细胞进行半量换液，此后隔天换液至第7 天，获得小鼠BMDM。培养过程中通过光学显微镜观察细胞贴壁生长情况。

1.6 小鼠BMDM 表面标志物抗原的鉴定

1.6.1 流式细胞术检测 取诱导分化7 d 后的小鼠BMDM，加入胰蛋白酶消化，收集细胞，PBS 洗涤2 次，加入PBS 50 μL 重悬细胞并调整至每管1×106个。细胞中加入0.5 μL FITC 标记的CD11b，避光室温孵育30 min；洗涤重悬，设置入射波长为488 nm，发射波长530 nm。吸取细胞悬液，300 目尼龙膜双层过滤至上样管，轻摇使细胞均匀分布。以不染色的空白组为对照，调整细胞群后，对染色细胞进行流式检测。

1.6.2 免疫荧光检测 取诱导分化7 d 后的小鼠BMDM，制备细胞爬片，加入4%多聚甲醛固定、封闭，加入 FITC 标记的CD11b 和 Texas red 标记 CD16 抗体，4 ℃避光孵育，DAPI 染色后，荧光显微镜观察。

1.7 小鼠BMDM 吞噬能力的鉴定 将E.coli BL21（DE3）（pET30a-GFP）划线接种于 LB 固体平板（含100 μg ／mL Kan），倒置过夜，挑单菌落于 10 mL LB 液体培养基（含 100 μg ／ mL Kan）中，1 mmol ／ L IPTG 37 ℃常规诱导3 h，取1 mL 菌液，离心收集菌体沉淀，加入PBS 洗涤后，用PBS 调整菌体密度为108CFU／mL，进行小鼠BMDM 吞噬能力检测：在诱导分化培养7 d后的小鼠BMDM 中加入经诱导后的E.coli BL21（DE3）（pET30a-GFP），感染复数为 1∶10，置 37 ℃，5% CO2培养箱中培养0.5 h，荧光显微镜下观察吞噬效果。

1.8 统计学分析 使用GraphPad Prism 8.0 软件进行统计学分析。数据以平均值±标准差（Mean±SD）表示。两组间比较采用独立样本t 检验（双尾法），以P < 0.05 为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 不同培养温度条件下L929 细胞上清中M-CSF的含量 L929 细胞分别于32 ℃培养10 d 和37 ℃培养3 d，细胞培养上清清澈无细胞漂浮物，颜色为粉红色；L929 细胞于37 ℃培养超过4 d 后，逐渐出现细胞漂浮物，因此选取32 ℃培养10 d 和37 ℃培养3 d 的L929 细胞上清作为小鼠BMDM 的诱导分化培养基。ELISA 检测结果显示，32 ℃培养10 d 的L929细胞上清中 M-CSF 的浓度［（44.14 ± 8.75）pg ／ mL］显著高于 37 ℃培养 3 d［（4.383 ± 0.73）pg ／ mL］，且差异有统计学意义（t = 11.09，P < 0.05）。

2.2 小鼠BMDM 的制备 显微镜观察显示，M-CSF和L929 细胞培养上清均能有效诱导小鼠骨髓细胞分化为巨噬细胞样细胞，经7 d 诱导处理后，细胞呈现多角形，形态均一，生长旺盛；相比于M-CSF，经32 ℃培养10 d 的L929 细胞培养上清处理后的细胞生长密度更大，且形态更均一。见图1。

图1 M-CSF（A）和L929 细胞培养上清（B）诱导分化小鼠BMDM 的比较（× 200）Fig.1 Differentiation of mouse BMDMs induced by M-CSF（A）and L929 cell culture supernatant（B）（× 200）

32 ℃培养10 d 的L929 细胞培养上清诱导小鼠骨髓细胞分化的能力更佳，尤其在诱导7 d 后，BMDM 生长旺盛，密度更大，形态更均一，状态更佳，见图2。

图2 不同培养条件L929 细胞上清诱导分化小鼠BMDM的比较（× 200）Fig.2 Differentiation of mouse BMDMs induced by L929 cell supernatant cultured under various condtions（× 200）

2.3 小鼠BMDM 表面标志物抗原的鉴定

2.3.1 流式细胞术检测 检测结果表明，小鼠BMDM CD11b 阳性率为80.62%，符合巨噬细胞表面标志物特性，见图3。

图3 小鼠BMDM CD11b 流式细胞术检测结果Fig.3 Flow cytometry of CD11b on mouse BMDMs

2.3.2 免疫荧光检测 荧光显微镜观察显示，经诱导分化的小鼠BMDM 均呈现FITC 所标记的绿色和Texas red 所标记的红色，表明经诱导分化后，BMDM表面具有巨噬细胞标志性抗原CD11b 和CD16，见图4。

图4 小鼠BMDM 的免疫荧光显微镜观察（× 200）Fig.4 IFA of mouse BMDMs（× 200）

2.4 小鼠BMDM 的吞噬能力 荧光显微镜下观察显示，大量巨噬细胞呈现出绿色荧光，表明表达绿色荧光的大肠埃希菌被巨噬细胞所吞噬，制备的小鼠BMDM 细胞具有吞噬能力，见图5。

图5 荧光显微镜观察小鼠BMDM 的吞噬能力Fig.5 Microscopy of phagocytosis ability of mouse BMDMs

3 讨 论

单核细胞由骨髓干细胞在骨髓中产生，并迁移至外周血和各种组织中分化为巨噬细胞。巨噬细胞是先天性和适应性免疫反应的重要组成部分，由于其强大的杀菌活性，成为抵御外来入侵的第一道防线。巨噬细胞吞噬微生物后，将其在溶酶体中降解，并向其他免疫细胞（如T 淋巴细胞）发送招募信号并呈递抗原。巨噬细胞广泛分布于全身，并大量存在于淋巴器官、肝、肺、胃肠道、骨骼和皮肤中，参与广泛的生理和病理过程。过去10年的研究表明，细胞来源和在组织中的定位不同，巨噬细胞在本质上也有所不同［13］。因此，从组织中大量获取原代具有典型巨噬细胞特征的同质细胞对真实反映吞噬细胞的生理特性更为重要。目前，实验室常规使用的是小鼠（RAW264.7 细胞）和人（PMA 分化的 THP-1 细胞）的巨噬细胞系，但它们具有细胞系模型固有的缺点，包括永生化以及基因表达谱不理想等问题。BMDM为一种易获得的大量具有多种巨噬细胞特性的同质细胞，其与体内的常驻巨噬细胞具有相似性，相关的免疫应答也与在各种病理生理环境中观察到的情况相似，因此被广泛用作体外研究的典型巨噬细胞［14-15］。此外，BMDM 是了解活化巨噬细胞极化机制的理想体外模型。如LPS 的刺激可诱导M1 巨噬细胞的活化，而IL-4 和IL-13 可诱导M2 巨噬细胞的极化，不同药物或诱导因子可调节BMDM 向M1和M2 亚型极化［16-17］。通过流式细胞术分析表面抗原的表达，可识别出成熟的BMDM 和活化的巨噬细胞，包括 CD11b、F4 ／80、CD11c、CD206、CD69、CD80、CD16 和 CD17。

小鼠BMDM 是用适当的生长因子在体外诱导分化小鼠骨髓中的前体细胞，并经适当培养获得的，主要是利用M-CSF 或L929 细胞培养上清进行诱导。M-CSF 通常为商品化购买获得，其对小鼠骨髓前体细胞的诱导分化能力受品质以及浓度的影响，往往需进行预实验确定M-CSF 的最适浓度；L929 细胞株于 1948年分离自 100日龄雄性 C3H ／ An 小鼠的正常皮下结缔组织中，并经亲本菌株传代95 代后所稳定获得的细胞系，常用来进行病原微生物的毒性测试，该细胞株常规培养所使用的培养系统为含10%马血清的MEM 培养基［18］。本实验为了避免后期使用L929 细胞培养上清诱导小鼠骨髓前体细胞分化时马血清对BMDM 细胞的影响，采用了含10%胎牛血清的MEM 培养基。实验证明，L929 细胞的培养上清液中富含较高活性的M-CSF，因此，成功用于对小鼠骨髓前体细胞的诱导分化过程中。L929细胞培养上清成分除M-CSF 外，还含有其他多种细胞因子，如高浓度的 VEGF、MCP-1、KC、MIG 和低浓度的FGF-β、嗜酸细胞活化趋化因子、IL-9、IL-10、IL-12 等［19-20］，推测这些细胞因子对小鼠骨髓源细胞的诱导起到一定的辅助作用。但以往文献中均显示［19-20］，用于诱导 BMDM 的 L929 细胞上清是将L929 细胞于37 ℃培养3 ～5 d 后收获的。本实验对L929 细胞的培养条件和小鼠BMDM 诱导分化环节进行了优化，将L929 细胞分别于37 ℃培养3 d和32 ℃培养10 d，分别收获细胞培养上清，用于制备BMDM，结果显示，32 ℃培养10 d 所收集的L929细胞培养上清可更高效地诱导小鼠骨髓前体细胞分化为BMDM，细胞生长旺盛，密度更高，形态更均一。分析原因，可能是由于L929 细胞在低于常规温度的培养条件下新陈代谢缓慢，对培养基中营养成分的摄取较低，可耐受长达10 d 的培养，并在较长的培养时间内积累了较多的M-CSF，且产生的代谢废物较少。本实验对两种温度条件下培养的L929 细胞上清中的M-CSF 进行了检测，结果也证实，32 ℃培养条件下的L929 细胞积累了浓度更高的M-CSF。因此，L929 细胞培养上清作为小鼠骨髓前体细胞的诱导剂能使BMDM 生长迅速，细胞形态均一，相比于M-CSF 更易控制诱导的浓度，也具有价格上的优势。而且，本研究推荐采用32 ℃条件下培养10 d 后收集的L929 细胞上清作为BMDM 的诱导条件培养基。在小鼠BMDM 的表面标志抗原鉴定试验中，我们使用了CD11b 标记后的流式细胞术检测以及CD11b、CD16 标记后的免疫荧光检测两种方法。结果显示，经L929 培养上清诱导获得的BMDM 均检测到巨噬细胞表面标志抗原的表达。在小鼠BMDM的吞噬能力鉴定中，本实验也采用了本实验室前期构建的表达绿色荧光的大肠埃希菌作为吞噬材料进行检测，其比传统的鸡红细胞具有材料易得、制备简单的优势，且比荧光微球价格低廉。

综上所述，本实验利用在32 ℃条件下培养10 d的L929 细胞上清诱导分化小鼠骨髓前体细胞，成功制备了小鼠BMDM，为研究免疫细胞功能、病原微生物与巨噬细胞相互作用提供了理想的细胞模型制备方法。