甲氨蝶呤(MTX)与匹莫齐特(Pimozide)联合使用对人胃癌细胞的抑制效果

牟大超 吴沙沙 周 轶 白秀峰

目前，肿瘤的治疗手段包括传统手术治疗、放化疗、小分子抑制剂治疗、单克隆抗体治疗以及细胞靶向治疗等[1-4]。传统的手术治疗不能保证病灶的完全切除，易复发[5,6]；放化疗会波及正常细胞，产生较强的毒副作用[7,8]；生物靶向治疗存在耐药性，且较难寻找肿瘤特异性抗原和治疗靶点等[9,10]；单一小分子药物使用时浓度高，易产生严重毒副作用，同时容易产生耐药性。随着研究深入，制备多种小分子的联合药物，有望使各药物分子发挥协同增加的作用，降低单一药物使用剂量，降低毒副作用和耐药性[11,12]。甲氨蝶呤(Methotrexate,MTX)是一种抗叶酸类抗肿瘤药，通过抑制二氢叶酸还原酶，使二氢叶酸不能还原成四氢叶酸，从而导致DNA的合成受到抑制而阻碍肿瘤细胞的合成，达到抗肿瘤目的，但单一长期使用可引起胃肠道反应、肝损伤和肾损伤等[13,14]。匹莫齐特(Pimozide)，近期报道显示，其可通过抑制stat3和stat5磷酸化水平，达到抗肿瘤目的，但单一使用效果不佳[15-16]。本文将MTX和Pimozide联合使用，探讨不同浓度配比对人胃癌细胞系MKN45和MKN74的抑制作用。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 细胞 人胃癌细胞系MKN45和MKN74由华西医院公共实验中心馈赠，本科室冻存。

1.1.2 主要试剂 细胞培养用RPMI 1640培养基和青霉素链霉素购自Gibco公司，胎牛血清购自阿根廷Natocor公司，CCK8检测试剂购自索莱宝公司。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养与孔板设置 体外培养MKN45和MKN74细胞系，培养基为RPMI 1640完全培养基(RPMI 1640基础培养基+10%新生牛血清)，细胞置于37℃，5%CO2细胞培养箱中培养。待细胞汇合度达到80%后，使用0.25%胰蛋白酶消化贴壁细胞。待细胞消化完成后，加入RPMI 1640完全培养基终止消化。300 g×5 min离心后，收集细胞。使用完全培养基重悬细胞沉淀，制成单细胞悬液，并进行细胞计数。用完全培养基稀释细胞，以每孔12000个细胞的密度接种于96孔板中，每孔体积为100 μl。设置空白对照孔：仅含100 μl完全培养基；细胞对照孔：仅含细胞和完全培养基，不加药物处理；药物处理孔：含细胞和不同浓度药物(药物为单独使用MTX、单独使用Pimozide以及MTX和Pimozide联合使用，药物用DMSO溶解，配制成10 mmol/L母液，使用时用培养基配制成相应浓度)。将96孔板置于二氧化碳孵箱中培养24 h。弃孔板中原培养基，加入新鲜培养基或完全培养基配制的不同浓度药物溶液。继续培养72 h。

1.2.2 细胞存活率检测 使用CCK8检测试剂盒，操作按说明书所示。在96孔板各孔中加入CCK8溶液10 μl，37℃孵箱中继续培养1～4 h。使用酶标仪，在450 nm波长下检测各孔吸光度OD值，记录结果，计算细胞存活率。每组实验设置3个复孔。细胞存活率计算公式：细胞存活率=(A药物处理孔-A空白对照孔)/(A细胞对照孔-A空白对照孔)。

1.2.3 药物联合使用协同指数计算 为了进一步分析MTX和Pimozide的协同作用效果，使用本领域认可且广泛使用的CompuSyn软件，对各浓度下MTX和Pimozide的协同指数进行了计算分析，协同指数CI<1.1表示有协同增效作用。

1.3 统计学分析

采用SPSS 20.0分析数据。细胞存活率分析采用单因素重复测量数据的方差分析，P<0.05判定为有统计学差异。

2 结果

2.1 单独/联合使用Pimozide(匹莫齐特)和MTX(甲氨蝶呤)对MKN45的抑制效果

单独使用Pimozide时，Pimozide剂量(0～1 μM)太小对MKN45细胞几乎没有抑制效果，只有Pimozide大剂量(2～4 μM)使用才对MKN45细胞有抑制效果(存活率<70%)，且随着Pimozide浓度增加，抑制效果增加。单独使用MTX时，对MKN45细胞的抑制效果均很差(各浓度下存活率均>70%)(表1、图1)。

图1 单独使用Pimozide或MTX抑制MKN45细胞的细胞存活率

Pimozide和MTX联合使用后，可以在减小药物使用剂量的情况下，显著提高对MKN45细胞的抑制效果，降低毒副作用。其中，当Pimozide浓度为4 μM，MTX浓度为0.1～20 μM时，细胞活性受到十分显著抑制，细胞存活率低于15%(表1、图2)。

图2 联合使用Pimozide和MTX抑制MKN45细胞的细胞存活率

表1 不同浓度MTX或/和Pimozide作用于MKN45细胞72h的细胞存活率

使用CompuSyn软件分析，当MTX浓度>0.1 μM时，各浓度Pimozide和MTX联合使用对MKN45的抑制效果具有协同增效作用(表2)。

表2 MTX和Pimozide联合药物作用于MKN45细胞72h的联合药物协同指数值(CI)

2.2 单独/联合使用Pimozide(匹莫齐特)和MTX(甲氨蝶呤)对MKN74的抑制效果

单独使用Pimozide时，Pimozide剂量(1 μM)太小对MKN74细胞几乎没有抑制效果，只有Pimozide大剂量(2～4 μM)使用才对MKN74细胞有抑制效果(存活率<70%)，随着Pimozide浓度增加，抑制效果增加。单独使用MTX时，对MKN74细胞的抑制效果均很差(表3、图3)。

图3 单独使用Pimozide或MTX抑制MKN74细胞的细胞存活率

Pimozide和MTX联合使用后，可以在减小药物使用剂量的情况下，显著提高对MKN74细胞有抑制效果。即Pimozide和MTX联合使用后既可以提高对胃癌细胞MKN74的抑制效果，又可以降低药物使用剂量，降低毒副作用。其中，当Pimozide浓度为4 μM，MTX浓度为0.01～20 μM时，细胞活性受到十分显著抑制，细胞存活率低于15%(表3、图4)。

图4 联合使用Pimozide和MTX抑制MKN74细胞的细胞存活率

表3 不同浓度MTX或/和Pimozide作用于MKN74细胞72 h的细胞存活率

使用CompuSyn软件分析，当Pimozide浓度>1 μM时，各浓度MTX和Pimozide联合使用对MKN74的抑制效果具有协同增效作用(表4)。

表4 使用CompuSyn软件计算MTX和Pimozide联合药物作用于MKN74细胞72h的联合药物协同指数值(CI)

3 讨论

甲氨蝶呤在肿瘤治疗领域的应用已有很长的历史，对多种肿瘤具有抑制作用，但大剂量使用会引起骨髓抑制和肝功能异常等不良反应[17-18]。匹莫齐特的抗肿瘤活性，最早由R Taub和M Baker报道[19]，用于黑色素瘤的治疗。近年来，越来越多的报道显示，匹莫齐特具有抗多种肿瘤活性[20-21]。但是，使用单一药物治疗肿瘤，需要的药物浓度较大，会产生很强的副作用。

将甲氨蝶呤和匹莫齐特联合使用，对肿瘤细胞，特别是胃癌细胞MKN45以及高转移胃癌细胞MKN74的抑制效果显著优于单独使用甲氨蝶呤和匹莫齐特，并发挥了协同增效抗肿瘤以及防止肿瘤转移的效果。此外，将甲氨蝶呤和匹莫齐特联合使用，可以减少药物的使用剂量，降低药物毒副作用，安全性更好。将甲氨蝶呤和匹莫齐特作为活性成分制备抗肿瘤药物，或者将甲氨蝶呤和匹莫齐特用于制备抗肿瘤联合用药物，具有良好的应用前景。