甲炎康泰对自身免疫性甲状腺炎大鼠PI3K/Akt/mTOR信号通路的影响

张秋娥 潘雅婧 张程斐 赵丹 吴丽丽 秦灵灵 刘铜华

自身免疫性甲状腺炎(autoimmune thyroiditis，AIT)是由于多因子功能紊乱导致的一种器官特异性自身免疫性疾病，其临床诊断通过血清甲状腺过氧化物酶抗体(thyroid peroxidase antibody，TPOAb)和抗甲状腺球蛋白抗体(anti-thyroglobulin antibodies，TgAb)的阳性表达以确诊[1]。目前遗传易感性、环境因素、营养因素和免疫紊乱是公认的导致AIT发生的重要因素[2-3]，但其病因未完全阐明，尚无针对病因的治疗手段。

磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B，Akt)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)信号通路长期以来被认为是细胞代谢、生长、存活的关键调节因子，mTOR是细胞内自噬的主要抑制因子，它受到PI3K/Akt通路的正调节。临床研究通过提取桥本甲状腺炎患者甲状腺滤泡上皮细胞进行研究，发现自噬相关蛋白减少。甲状腺滤泡细胞自噬参与了桥本甲状腺炎的发展[4]，激活PI3K/Akt/mTOR信号通路使AIT的症状加重[5-6]。因此，研究组推测甲炎康泰可能作用于PI3K/Akt/mTOR信号通路，参与了对细胞自噬的调节作用来改善AIT病情。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF级Lewis大鼠30只，6周龄，雌性，体质量115～145 g。购于北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号：SCXK(京)2016-0006。

1.2 实验药物

甲炎康泰组方：柴胡10 g、郁金20 g、夏枯草30 g、穿山龙10 g、浙贝母15 g、玄参10 g、山慈菇6 g、黄芪30 g、乌梅15 g。甲炎康泰颗粒剂购于北京康仁堂药业有限公司，溶于去离子水，置于4℃冰箱储存。参考课题组前期实验结果，本实验给药剂量2.834 g/kg[7]。

1.3 实验试剂

碘化钠(玛雅试剂有限公司产品，批号：MA-YA-CR-2831)，猪甲状腺球蛋白(Thyroglobulin from Porcine thyroid gland，PTg)(美国Sigma公司，批号：#018K7012)，弗氏不完全佐剂(Incomplete Freunds Adjuvant，IFA)(美国Sigma公司，批号：#SLCB8702)，弗氏完全佐剂(Complete Freunds Adjuvant，CFA)(美国Sigma公司，批号：#SLCF1289)，TPO-Ab Elisa kit(CUSABIO，批号：CO331050347)，Trizol(美国Ambion公司)，异丙醇(北京化工厂)，PCR试剂盒(南京维诺赞生物科技股份有限公司)，BASO脱蜡剂(珠海贝索生物技术有限公司，批号：C210702)，无水乙醇(北京化工厂)，伊红(美国Sigma公司)，PI3KCA(proteintech公司，货号：20583-I-AP)，Anti-Akt1 (phospho S473)(Abcam公司，批号：GR150067-1)，Phospho-mTOR (Ser2448)(CST公司)，苏木精染色液(北京普利莱基因技术有限公司，货号：C1411)，羊血清工作液(北京中杉金桥生物技术有限公司，批号：2109D0617)，DAB显色试剂盒(北京普利莱基因技术有限公司，批号：20A1CB1072)，中性树胶(北京普利莱基因技术有限公司)。GAPDH、PI3K、Akt、mTOR基因的PCR引物均由上海生工生物工程股份有限公司设计、合成(引物序列及引物长度见表1)。

乳化剂的配制：实验时将1 mg PTg溶于1L PBS得到0.1% PTg溶液，再按等体积比例将该溶液与CFA研磨混合成乳剂得到终浓度0.05% PTg-CFA乳剂；同法配制0.05% PTg-IFA乳剂。碘化钠水溶液的配制：100 mL去离子水中加入64 mg NaI，配制成0.064% NaI溶液。

以上试剂现用现配，碘化钠水溶液注意避光。

1.4 实验仪器

台式高速冷冻离心机(德国SIGMA公司，3K15)；Thermo labsystem MK3酶标仪(美国Thermo公司)；OLYMPUS BH-2光镜(日本奥林巴斯公司)；全自动新型电热培养箱(上海智诚分析仪器制造有限公司)；其他手术相关器械。

1.5 实验方法

1.5.1 动物分组与造模 建立AIT模型[8]：根据体质量，采用区组随机法选取10只Lewis大鼠为正常对照组，其余为造模组。第一周适应性喂养正常进食饮水，第二周开始AIT造模，造模组Lewis大鼠自由饮用0.064% NaI溶液，正常对照组Lewis大鼠自由饮水。第3周造模组Lewis大鼠行初次免疫：每次在每只Lewis大鼠双侧腹股沟皮下、背部皮下、颈部皮下多点注射PTg-CFA乳剂0.2 mL，此周皮下注射2次，间隔三天。加强免疫：第4～8周配制PTg-IFA乳剂进行每周1次的皮下多点注射。造模成功验证方法：采集大鼠眶静脉血，Elisa法检测大鼠血清中TPOAb抗体水平。

1.5.2 给药方法 造模结束后，根据TPOAb浓度，将成模大鼠随机分为模型组与甲炎康泰组，每组10只，第8周开始给药。甲炎康泰组大鼠给予甲炎康泰水溶液灌胃，其余组予等体积去离子水灌胃，灌药体积为1 mL/100 mg，每日一次。连续给药8周。

1.5.3 取材方法 各组大鼠灌胃干预8周后，禁食12小时，腹腔注射2%戊巴比妥钠溶液(40 mg/kg)，麻醉后行腹主动脉取血，负压真空采血管采集外周血，室温静置后离心(4℃，3 000r/min)10分钟，吸取上清，-80℃冰箱超低温保存，用于后续血清指标检测(本实验中每组取6只大鼠血清进行Elisa检测)；每组取6只大鼠的甲状腺组织用于后续苏木精—伊红(hematoxylin-eosin，HE)染色以及免疫组织化学检测，另一侧甲状腺组织进行PCR检测(因RNA纯度问题，最终本实验中用4只)。

1.6 指标检测

1.6.1 血清抗体检测 Elisa法检测大鼠外周血清中TPOAb抗体水平。按说明书：酶标板加10 μL标准品、样品，另设空白孔，加一抗50 μL(空白孔不加)，37℃恒温培养箱1小时，wash buffer洗板后加入二抗50 μL，37℃恒温培养箱30分钟，洗板完毕加显色液避光显色15分钟，酶标仪读取OD值，拟合标准曲线计算TPOAb浓度。

1.6.2 病理变化观察 取甲状腺组织，石蜡包埋，切片，二甲苯脱蜡，梯度乙醇脱水，自来水低速冲洗，苏木精染色5分钟，加0.5%的盐酸，加入0.5%的氨水回蓝30秒，伊红溶液染色2分钟，乙醇梯度处理，二甲苯浸泡，封片，镜下观察病理变化。

1.6.3 实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR，qRT-PCR) 采用逆转录定量PCR方法检测甲状腺组织中PI3K、Akt、mTOR mRNA的表达。Trizol法提取甲状腺组织RNA后，利用反转录试剂盒，根据说明书，以37℃，15分钟；85℃，5秒进行反转录。PCR反应体系：10 μL SYBR qPCR Master Mix，0.04 μL上引，1 μL下引，2μL cDNA稀释液，7.92 μL dH2O。PCR扩增依据厂商说明书条件：95℃预变性30秒；95℃变性5秒，退火60℃延伸30秒，循环反应40次，95℃，15秒，60℃持续60秒，采集溶解曲线，最后统计Ct值，结果以GAPDH为内参，正常组样本为对照，采用2-△△Ct相对定量法比较各组目标mRNA的表达差异。引物序列见表1。

表1 qRT-PCR引物

1.6.4 免疫组织化学分析 甲状腺组织石蜡包埋切片后脱蜡复水，Trition、3%H2O2处理，柠檬酸盐溶液高温抗原修复，山羊血清封闭，滴加一抗4℃，12小时后复温PBS冲洗，滴加二抗，DAB显色，苏木精染色，自来水低速冲洗，酒精梯度脱水，BASO脱蜡剂浸泡，滴加中性树胶封片。镜下拍照分析，运用Image-Pro Plus6.0，Media Cybernetics系统进行吸光度检测，分析PI3K、P-Akt、P-mTOR的平均光密度(IOD/Area)，进行统计学处理。

1.7 数据处理

2 结果

2.1 各组大鼠外周血中TPOAb浓度测定

与正常组大鼠比较，模型组大鼠外周血TPOAb滴度值均升高(P<0.05)。与模型组相比，甲炎康泰组TPOAb滴度值降低，差异具有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 各组大鼠血清TPOAb含量比较

2.2 各组大鼠甲状腺病理观察

200倍镜下可见正常组大鼠甲状腺滤泡上皮细胞排列整齐，滤泡圆形完整，滤泡腔内胶质丰富，未见淋巴细胞等浸润；与正常组对比，模型组AIT大鼠甲状腺滤泡上皮细胞可见明显破坏，滤泡部分萎缩甚至消失，滤泡腔内胶质减少，滤泡间隙可见明显浸润淋巴细胞；甲炎康泰组大鼠甲状腺滤泡上皮细胞较完整，滤泡形态较规则，镜下可见胶质略少，甲状腺滤泡细胞间偶见淋巴细胞浸润，与模型组比较普遍轻微。见图1。

注: A 正常组；B 模型组；C 甲炎康泰组。

2.3 各组大鼠甲状腺组织中PI3K、Akt、mTOR的mRNA表达情况

模型组大鼠甲状腺组织PI3K、Akt、mTOR的mRNA表达较正常组显著升高(P<0.05)；与模型组比较，甲炎康泰组PI3K、Akt、mTOR的mRNA表达降低，差异具有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表3 各组大鼠甲状腺组织PI3K、Akt、mTOR的mRNA表达情况比较

2.4 各组大鼠甲状腺组织中PI3K、P-Akt、P-mTOR蛋白表达情况

400倍镜下可见各组大鼠甲状腺组织PI3K、P-Akt、P-mTOR免疫阳性物呈棕色，计算并统计平均光密度值，正常组大鼠甲状腺组织内有较少PI3K、P-Akt、P-mTOR蛋白表达，模型组大鼠PI3K、P-Akt、P-mTOR蛋白均为阳性表达。与模型组比较，甲炎康泰组PI3K、P-Akt、P-mTOR蛋白表达减少(P<0.05)，见表4，图2、3、4。

表4 各组大鼠甲状腺组织PI3K、P-Akt、P-mTOR蛋白表达比较

注: A 正常组；B 模型组；C 甲炎康泰组。

注: A 正常组；B 模型组；C 甲炎康泰组。

注: A 正常组；B 模型组；C 甲炎康泰组。

3 讨论

AIT是一种常见的器官特异性自体免疫性疾病，起病隐匿,病程较长,病情反复，常合并其他自身免疫性疾病[9-11]，可引起女性不孕、流产[12]、脱发[13]等。除了躯体并发症，患者也可能出现精神障碍，如抑郁症、焦虑症[14]等。AIT迁延不愈，可导致甲亢反复发生，可并发甲状腺结节，最终导致甲状腺功能减退而不得不采用替代治疗[1]。AIT发病主要是自身免疫耐受被破坏的结果，细胞和体液免疫反应，特异性地影响特定组织[15-17]，其中T淋巴细胞直接破坏甲状腺组织，导致一系列连锁反应，其分泌的细胞因子等可通过触发和增强免疫应答及炎性反应而加剧AIT病变[15]。

PI3K/Akt/mTOR信号通路作为自噬的经典途径，已被证明在AIT的发生发展中起着重要作用[6,18-20]，此通路是由一系列不同的反应通过特定的受体激活的生长因子(包括激素、细胞因子和趋化因子)通过各种机制激活PI3K。PI3K启动磷酸肌醇-3激酶调控通路，特异性结合Akt和磷酸肌醇依赖的蛋白激酶1(phosphoinositide-dependent protein kinase-1，PDK1)，促进PDK1对Akt磷酸化和激活[21]，Akt间接激活mTOR，当TSC2在Ser939被激活的Akt磷酸化时，它从TSC1分离出来[22]，导致mTORC1的激活，mTORC1直接磷酸化下游底物，抑制自噬[23]。自噬是一种保守的细胞过程，涉及自噬体的形成，自噬体包裹着细胞质货物，包括长寿命蛋白质、蛋白质聚集体和细胞器，并将这些货物输送到溶酶体进行降解[24]。最新研究已经证明了自噬在先天性和适应性免疫反应中的重要作用[24-26]。T细胞在胸腺从分化到成熟、在外周的存活和其功能受到自噬水平的影响[26]。此外，自噬的诱导促进了抗原肽递送到主要组织相容性复合物II类负载区，并随后表达到CD4+T细胞[27-28]。自噬过程参与了自身免疫和炎性疾病的发展，对免疫和炎症的有益和有害影响起到了平衡作用[29]。T细胞消融引起严重的自身免疫反应，与mTOR激活和代谢重编程有关，这些激活引起外周T细胞的自发激活和加速分化，药物性mTOR抑制剂对T细胞缺陷和免疫调节障碍有积极作用[30]。

AIT可归属于中医“瘿病”“瘿瘤”等范畴，中医药特色治疗在AIT的治疗方面有着独特优势[31]。甲炎康泰(专利号CN106421633A)由柴胡、郁金、夏枯草、穿山龙、浙贝母、玄参、山慈菇、黄芪、乌梅组方而成，是刘铜华教授在多年临床治疗中不断总结而成的疗效明确的经验方。本病诱因主要为情志失调，致肝郁气滞。肝郁犯脾，脾虚痰积，气滞、痰结瘀阻于颈前，日久因实致虚，伤阴耗气，损及阴阳。因此，甲炎康泰全方功以疏肝理气，可达到消痰散结化瘀的治疗目的[32]。

前期研究显示，甲炎康泰能降低Th17/Treg比例，下调血清白介素(interleukin，IL)-6、IL-17A、IL-23p19、转化生长因子-β1等Th17相关细胞因子分泌，上调血清IL-2、IL-10等Treg相关细胞因子分泌[33]，纠正Th1/Th2失衡[34]。本次实验结果表明，与模型组相比，甲炎康泰组大鼠外周血TPOAb滴度降低，给药甲炎康泰干预后甲状腺组织淋巴细胞浸润减轻，一定程度上缓解了AIT病情。相比模型组，甲炎康泰组甲状腺组织中PI3K、Akt、mTOR mRNA相对表达量明显下降，PI3K、P-Akt、P-mTOR蛋白表达量明显下降。因此，甲炎康泰可能通过抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路，促进细胞自噬，来维持T细胞稳态，进而减轻炎症反应，延缓AIT发生发展。

综上所述，甲炎康泰治疗AIT可能与其能够抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路有关。但本实验仅初步验证了甲炎康泰对于PI3K/Akt/mTOR信号通路的调节作用，下游靶蛋白等尚未进行验证，与其他信号通路是否有协同作用，也有待更进一步的实验探索。