斑马鱼胚胎行为学在化妆品原料舒缓功效评价中的应用

何健华，郭清泉，王雅馨，何露露，袁宇玺，吴少娟，赵海山

1.广东工业大学 轻工化工学院，广东 广州 510006；2.广州山海生物科技有限公司，广东 广州 510700；3.广东省人民医院(广东省医学科学院)，广东 广州 510080

0 引言

根据《化妆品分类规则和分类目录》[1]中的释义和说明，舒缓是指有助于改善皮肤刺激等状态的一种功效。皮肤刺激是指皮肤在受到物理、化学等外界因素刺激时出现刺痛、灼热、瘙痒等主观症状或红斑、毛细血管扩张等客观症状[2]。气候变化、环境污染、化妆品原料种类多样化等因素均有诱发皮肤刺激的可能性，并且随着人们护肤意识的增强，以及对皮肤刺激了解的加深，宣称舒缓功效的化妆品逐渐受到关注和重视，但是对于舒缓功效的评价，目前尚缺乏标准、统一的方法。

目前实验室的舒缓功效评价方法多以炎症为指标，如有研究[3]利用脂多糖诱导产生巨噬细胞RAW264.7，通过测定相关炎症因子的含量评价化妆品原料的舒缓功效；孔雪等[4]认为，可将外源刺激作用于皮肤模型上，经化妆品原料处理后，通过测定相关炎症因子的表达情况来评估其舒缓功效。然而皮肤刺激是一个涉及人体皮肤屏障功能、神经因素及炎症反应的复杂过程[2]，因此抗炎并非是评估化妆品原料舒缓功效的唯一指标。夏高辉等[5]研究发现，黄芩、积雪草等植物提取物能有效抑制透明质酸酶的活性，从而增强皮肤屏障。J. Roeding等[6]通过人体测试发现，抑制神经末梢感受器的TRPV1受体的活性可以有效舒缓辣椒素激活的皮肤刺激。但是透明质酸酶抑制实验使用的是体外模型，难以贴近人体环境；而人体测试难以在数量庞大的化妆品原料初筛中得到广泛应用。

斑马鱼模型是一种成本低、稳定性好、适用于大通量的动物评价模型。作为化妆品原料刺激性评价模型，其优势在于：斑马鱼全年产卵且数量多，样本量大；胚胎透明，给药方式简单，可以直接观察化妆品原料对鱼体内脏器官的影响；斑马鱼与人类的基因高度相似，在斑马鱼上得到的评价结果多数情况下也适用于人体[7-8]。目前应用广泛的斑马鱼炎症模型，是在荧光显微镜下观察皮肤炎症部位的中性粒细胞或巨噬细胞的分布情况，采用图像处理软件统计其数量，进而评估舒缓功效[9]。但是该模型需要长时间的预处理，难以在化妆品原料筛选中推广应用，并且抑制皮肤炎症并不是评价化妆品舒缓功效的唯一指标。因此，寻找一种可靠、低成本、贴合人体环境并且适用于化妆品原料高通量筛选的舒缓功效评价方法成为迫切需求。

研究[10]表明，斑马鱼胚胎发育至24 h(24 hours post-fertilization，简称“24 hpf”，下同)会产生自发的自旋运动。斑马鱼胚胎的自旋运动频率与其受到的外界刺激直接相关，曾被用于环境毒理评价[11-13]，但在化妆品领域的应用尚未见报道。因此，本研究拟以斑马鱼胚胎的自旋运动频率为指标筛选造模剂，建立斑马鱼刺激模型用于评价常用化妆品原料(甘草酸二钾、黄芩素)的舒缓功效，并使用传统斑马鱼炎症模型进行验证对比；利用斑马鱼刺激模型筛选丹皮酚、α-红没药醇、积雪草苷、原花青素及4-叔丁基环己醇5种常见的舒缓原料对斑马鱼胚胎的舒缓功效，以期为化妆品原料的开发和舒缓功效的提升提供评价方法。

1 材料与方法

1.1 试剂、材料和仪器

主要试剂：甘草酸二钾(纯度98%)、丹皮酚(纯度99%)、十二烷基硫酸钠(SDS，纯度99%)，购自上海麦克林生化科技有限公司；二甲基亚砜(DMSO，分析纯)，购自天津市大茂化学试剂厂；原花青素(纯度99%)、4-叔丁基环己醇(纯度98%)，购自前衍化学科技(武汉)有限公司；黄芩素(纯度98%)，购自上海易恩化学技术有限公司；积雪草苷(纯度99%)，购自成都植标化纯生物技术有限公司；4-丁基间苯二酚(纯度99.9%)，购自广州汀兰生物科技有限公司。

材料：实验所用斑马鱼品种为AB系及Tg[lyz:DsRed]系，成年鱼龄为6～12个月，均购于国家斑马鱼资源中心。

主要仪器：SZ680型体式显微镜(带平板液晶数码成像系统)，重庆奥特光学仪器有限责任公司产；Axio Imager.2型荧光正置显微镜，德国Carl ZISSE公司产；LBI-175-N型生化培养箱，上海龙跃仪器设备有限公司产。

1.2 实验方法

1.2.1 斑马鱼胚胎的获取Holt-Buffer培养液的配制：量取1900 mL 超纯水，置于2 L烧杯中，依次加入7.000 g NaCl，0.400 g NaHCO3，0.100 g KCl和0.235 g CaCl2，超纯水定容至2000 mL，过滤，常温贮存备用。

斑马鱼饲养在斑马鱼养殖系统中进行，早上和下午定时喂食丰年虫。饲养水温为(28.5±0.5) ℃，pH值为7.5±0.5，光周期为14 h光照、10 h黑暗。收集胚胎的前一天下午，选取健康的成年斑马鱼，按雌雄1∶1配对放入配种缸中，并用隔板将雌雄斑马鱼隔开。次日早上亮灯后，抽离隔板，自由交配1 h后收集胚胎。收集的胚胎经清洗、挑选后加入适量的Holt-Buffer培养液，置于(28.5±0.5) ℃生化培养箱中孵育待用。按照C.B.Kimmel等[14]的方法对斑马鱼发育阶段进行分期。

1.2.2 斑马鱼刺激模型的建立将4-丁基间苯二酚溶于DMSO配制成母液，使用Holt-Buffer培养液将其稀释至4-丁基间苯二酚浓度分别为5 μmol/L、20 μmol/L、80 μmol/L(DMSO终体积分数为1%)。随机挑选发育健康、状态一致、24 hpf的AB系斑马鱼胚胎置于96孔板中，每孔7枚，分别加入上述浓度的4-丁基间苯二酚稀释液，每孔200 μL，每个浓度设置3个复孔，同时设置空白对照组(Holt-Buffer培养液处理组，DMSO终体积分数为1%)。将SDS溶于Holt-Buffer培养液，配制成125 μmol/L、250 μmol/L、500 μmol/L的溶液。随机挑选发育健康、状态一致、24 hpf的AB系斑马鱼胚胎置于96孔板中，每孔7枚，分别加入上述浓度的SDS溶液，每孔200 μL，每个浓度设置3个复孔，同时设置空白对照组(Holt-Buffer培养液处理组)。

4-丁基间苯二酚处理组和空白对照组，于1 h内，每隔20 min，采用体式显微镜录像记录30 s内斑马鱼胚胎的自旋运动次数。SDS处理组和空白对照组，于45 min内，每隔15 min，同样记录30 s内斑马鱼胚胎的自旋运动次数。根据斑马鱼胚胎的自旋运动次数计算刺激强度，计算公式如下：

①

式中，n为处理组斑马鱼胚胎自旋运动的平均次数/次；m为空白对照组斑马鱼胚胎自旋运动的平均次数/次。

1.2.3 斑马鱼刺激模型的验证1)甘草酸二钾和黄芩素的舒缓功效评价。将甘草酸二钾溶于Holt-Buffer培养液，配制成250 μmol/L、500 μmol/L、1000 μmol/L的溶液。随机挑选发育健康、状态一致、24 hpf的AB系斑马鱼胚胎置于96孔板中，每孔7枚，分别加入上述浓度的甘草酸二钾溶液，每孔200 μL，每个浓度设置3个复孔，处理1 h，同时设置空白对照组(Holt-Buffer培养液处理组)。将黄芩素溶于DMSO配制成母液，使用Holt-Buffer培养液将其稀释至黄芩素浓度分别为25 μmol/L、50 μmol/L、100 μmol/L(DMSO终体积分数为1%)。随机挑选发育健康、状态一致、24 hpf的AB系斑马鱼胚胎置于96孔板中，每孔7枚，分别加入上述浓度的黄芩素稀释液，每孔200 μL，每个浓度设置3个复孔，处理1 h，同时设置空白对照组(Holt-Buffer培养液处理组，DMSO终体积分数为1%)。处理结束后，采用体式显微镜录像记录30 s内斑马鱼胚胎的自旋运动次数。将斑马鱼胚胎未出现死亡且自旋运动次数与空白对照组对比无显著增加的浓度组别分别确定为甘草酸二钾和黄芩素的无可观察效应浓度(NOEC)。

随机挑选发育健康、状态一致、24 hpf的AB系斑马鱼胚胎置于96孔板中，每孔7枚，分别加入250 μmol/L、500 μmol/L、1000 μmol/L的甘草酸二钾溶液或25 μmol/L、50 μmol/L、100 μmol/L的黄芩素稀释液，每孔200 μL，每个浓度设置3个复孔，处理1 h，同时设置空白对照组。处理结束后，除去96孔板中的溶液，按体积比1∶1分别加入甘草酸二钾与SDS混合液、黄芩素与SDS混合液(甘草酸二钾、黄芩素的终浓度保持不变，SDS的终浓度为500 μmol/L)，处理15 min，然后采用体式显微镜录像记录30 s内斑马鱼胚胎的自旋运动次数。根据式①计算刺激强度，并通过比较斑马鱼胚胎刺激强度的变化来评估甘草酸二钾和黄芩素的的舒缓功效。

2)甘草酸二钾和黄芩素的抗炎作用评价。随机挑选发育健康、状态一致、48 hpf的Tg[lyz:DsRed]系斑马鱼胚胎置于24孔板中，每孔10枚，分别加入1 mL 250 μmol/L、500 μmol/L、1000 μmol/L的甘草酸二钾溶液或12.5 μmol/L、25 μmol/L、50 μmol/L的黄芩素稀释液，每孔1 mL，处理24 h，同时设置空白对照组。处理结束后，除去24孔板中的溶液，按体积比1∶1分别加入甘草酸二钾与SDS混合液、黄芩素与SDS混合液(甘草酸二钾、黄芩素的终浓度保持不变，SDS的终浓度为100 μmol/L)，处理3 h。接着用Holt-Buffer培养液将胚胎清洗3次以除去药液。在载玻片上滴加1滴质量分数为3%的甲基纤维素溶液，并将胚胎置于其上固定，在体式显微镜下调整胚胎的位置，最后将载玻片置于正置荧光显微镜下，选用Rhod通道对胚胎进行拍照，每组选取5枚。利用Image J软件计算各处理组斑马鱼卵黄末端至尾部的中性粒细胞数目与空白组数目的比值，得到中性粒细胞相对数目/%，定量评价甘草酸二钾和黄芩素对斑马鱼炎症模型的抗炎作用。

1.2.4 斑马鱼刺激模型应用于筛选化妆品舒缓原料根据4-叔丁基环己醇、积雪草苷、原花青素、α-红没药醇、丹皮酚5种化妆品原料的溶解特性，分别配制成高浓度的溶液(水溶性或易在水中分散的原料使用Holt-Buffer培养液溶解；难溶于水或不溶于水的化妆品原料使用DMSO溶解)。实验前，分别用Holt-Buffer培养液将不同浓度的溶液等比稀释10倍，每种化妆品原料设置3个实验浓度组。随机挑选发育健康、状态一致、24 hpf的AB系斑马鱼胚胎置于96孔板中，每孔7枚，分别加入不同浓度的化妆品原料稀释液，每孔200 μL，每个浓度设置3个复孔，处理1 h，同时设置空白对照组。处理结束后，采用体式显微镜录像记录30 s内斑马鱼胚胎的自旋运动次数。将斑马鱼胚胎未出现死亡、自旋运动的次数与空白对照组对比无显著增加的浓度组别确定为化妆品原料的NOEC。

随机挑选发育健康、状态一致、24 hpf的AB系斑马鱼胚胎置于96孔板中，每孔7枚，分别加入不同浓度的化妆品原料液，每种化妆品原料设置3个实验浓度组，每孔200 μL，每个浓度设置3个复孔，处理1 h，同时设置空白对照组。处理结束后，除去96孔板中的溶液，按体积比为1∶1加入混合液(化妆品原料液的终浓度保持不变，SDS的终浓度为500 μmol/L)，处理15 min，然后采用体式显微镜录像记录30 s内斑马鱼胚胎的自旋运动次数。根据式①计算刺激强度，并通过比较斑马鱼胚胎刺激强度的变化评估5种化妆品原料的舒缓功效。

1.2.5 数据处理与统计学分析使用Excel2016、GraphPad Prism 8对数据进行处理和统计学分析，数据以(平均值±标准差)表示。使用Origin2018软件作图，多组间采用单因素方差分析(one-way ANOVA)进行显著性检验，以P<0.05表示具有显著性差异。

2 结果与讨论

2.1 斑马鱼刺激模型构建分析

4-丁基间苯二酚是化妆品中常用的美白原料，SDS是化妆品中常用的表面活性剂，两者均可能导致皮肤刺激的发生[15-16]。因此，本文分别以4-丁基间苯二酚和SDS为造模剂建立斑马鱼刺激模型，不同浓度的4-丁基间苯二酚和SDS在不同作用时间对24 hpf斑马鱼胚胎的影响如图1所示，其中***表示与空白对照组对比，P<0.001。

从图1a)可以看出，与空白对照组相比，浓度为80 μmol/L 的4-丁基间苯二酚作用40 min时，斑马鱼胚胎刺激强度具有极显著差异(P<0.001)，说明4-丁基间苯二酚在该浓度下表现出较强的刺激性；由图1b)可以看出，与空白对照组相比，浓度为500 μmol/L的SDS作用15 min时，斑马鱼胚胎刺激强度具有极显著差异(P<0.001)，说明SDS在该浓度下表现出较强的刺激性。

图1 不同浓度的4-丁基间苯二酚和SDS在不同作用时间对24 hpf斑马鱼胚胎的影响Fig.1 Effects of different concentrations of 4-butylresorcinol and sodium dodecyl sulfate on 24 hpf zebrafish embryos at different functional time

确定4-丁基间苯二酚、SDS作用时间及浓度后，对斑马鱼刺激模型的稳定性进行测试：将4-丁基间苯二酚、SDS分别重复4次实验并计算数据的相对标准差(RSD)，结果见表1。由表1可见，4-丁基间苯二酚的RSD大于SDS的RSD，说明前者对斑马鱼胚胎刺激作用的重复性(稳定性)较差。因此选用作用时间15 min、浓度500 μmol/L的SDS构建斑马鱼刺激模型。

表1 4-丁基间苯二酚和SDS对24 hpf斑马鱼胚胎的影响Table 1 Effects of 4-butylresorcinol and SDS on 24 hpf zebrafish embryos

2.2 斑马鱼刺激模型的验证对比

2.2.1 斑马鱼刺激模型对甘草酸二钾和黄芩素舒缓功效的评价甘草酸二钾具有显著的抗炎活性[17]，黄芩素在化妆品中具有较好的舒缓抗敏功效[18]，两者均对皮肤具有较好的舒缓作用。因此，本文首先确定甘草酸二钾和黄芩素的NOEC，并使用斑马鱼刺激模型对其进行舒缓功效评价，以验证该模型的可行性。

表2为甘草酸二钾和黄芩素处理对24 hpf斑马鱼胚胎的影响。由表2可知，浓度为1000 μmol/L的甘草酸二钾和浓度为100 μmol/L的黄芩素分别对斑马鱼胚胎处理1 h后，与空白对照组相比，刺激强度未出现显著增加,且胚胎未出现死亡。

表2 甘草酸二钾和黄芩素处理对24 hpf斑马鱼胚胎的影响Table 2 Effects of dipotassium glycyrrhizinate and baicalein on 24 hpf zebrafish embryos

确定甘草酸二钾和黄芩素的NOEC后，使用前述建立的斑马鱼刺激模型对其进行舒缓功效评价。甘草酸二钾和黄芩素对24 hpf斑马鱼胚胎刺激的舒缓功效如图2所示。其中，*表示与模型组对比，P<0.05；** 表示与模型组对比，P<0.01；*** 表示与模型组对比，P<0.001；**** 表示与模型组对比，P<0.000 1，下同。与模型组相比，甘草酸二钾在低、中、高浓度的3个给药组中，胚胎的刺激强度明显下降(P<0.05)，具有显著性差异(图2a))；黄芩素在低、中、高浓度的3个给药组中，胚胎的刺激强度明显下降(P<0.01、P<0.000 1)，具有显著差异(图2b))。

图2 甘草酸二钾和黄芩素对24 hpf斑马鱼胚胎刺激的舒缓功效Fig.2 Soothing efficacy of dipotassium glycyrrhizinate and baicalin on 24 hpf zebrafish embryos

以上结果表明，甘草酸二钾和黄芩素均能有效抑制SDS引起的斑马鱼胚胎刺激强度增强的现象，两者在斑马鱼刺激模型中的舒缓作用分别与施米丽等[19]和区梓聪等[18]的研究结果一致，表明该模型可用于评价化妆品原料的舒缓功效。

2.2.2 传统斑马鱼炎症模型对甘草酸二钾和黄芩素抗炎作用的评价抗炎作用是目前评价舒缓皮肤

刺激功效的重要指标之一。斑马鱼与人的皮肤结构高度相似[20]，可以通过目前广泛应用的斑马鱼炎症模型评价甘草酸二钾、黄芩素的抗炎作用，从而评估其舒缓功效。中性粒细胞的激活、迁移、募集是炎症反应的显著特征，可以反映机体的炎症程度[21]，因此通过计算斑马鱼体内中性粒细胞的数量即可评估原料的抗炎作用。

选用Tg[lyz:DsRed]系斑马鱼作为研究对象，将其中性粒细胞标记为红色，甘草酸二钾和黄芩素分别处理后，斑马鱼体内中性粒细胞的分布情况与相对数目如图3、图4所示，其中，ns表示与模型组相比，P>0.05，下同。由图3可以看出，与模型组相比，浓度为250 μmol/L的甘草酸二钾处理后，斑马鱼尾部的中性粒细胞数目无显著变化(P>0.05)；浓度为500 μmol/L、1000 μmol/L的甘草酸二钾分别处理后，斑马鱼尾部的中性粒细胞的募集均得到有效抑制(P<0.05、P<0.01)。由图4可以看出，与模型组相比，浓度为12.5 μmol/L、25 μmol/L的黄芩素分别处理后，斑马鱼尾部的中性粒细胞数目无显著变化(P>0.05)；浓度为50 μmol/L的黄芩素处理后，斑马鱼尾部的中性粒细胞数目的募集得到有效抑制(P<0.001)。这说明甘草酸二钾与黄芩素在安全浓度范围内均能有效抑制斑马鱼体内中性粒细胞的募集，从而有效抑制SDS诱导的皮肤炎症。

图3 甘草酸二钾处理后斑马鱼体内中性粒细胞的分布情况与相对数目Fig.3 The distribution and the number of neutrophils in vivo of zebrafish by dipotassium glycyrrhizate

图4 黄芩素处理后斑马鱼体内中性粒细胞的分布情况与相对数目Fig.4 The distribution and the number of neutrophils in vivo of zebrafish by baicalein

由此可知，甘草酸二钾和黄芩素在斑马鱼刺激模型中的舒缓功效与在传统斑马鱼炎症模型中的舒缓功效基本一致，也与大多数已有的评价方法研究结果吻合[18-19,22]。因此推论基于斑马鱼胚胎行为学构建的斑马鱼刺激模型亦可用于化妆品原料舒缓功效评价。

2.3 常见化妆品舒缓原料的筛选

α-红没药醇[23]、丹皮酚[24]、积雪草苷[25]、原花青素[26]、4-叔丁基环己醇[27]在化妆品中均具有一定的舒缓功效及抗炎作用。表3为5种化妆品原料处理对24 hpf斑马鱼胚胎的影响。由表3可知，与空白对照组相比，5种化妆品原料对斑马鱼胚胎处理1 h后，刺激强度未出现显著性增加且未造成胚胎死亡。

表3 5种化妆品原料处理对24 hpf斑马鱼胚胎的影响Table 3 Effects of 5 cosmetic raw materials on 24 hpf zebrafish embryos

确定5种化妆品原料的NOEC后，使用斑马鱼刺激模型对其进行舒缓功效评价。5种化妆品原料对24 hpf斑马鱼胚胎刺激的舒缓功效如图5所示。由图5可以看出，与模型组相比，α-红没药醇在中、高浓度的2个给药组中，胚胎的刺激强度明显下降(P<0.05、P<0.000 1)，具有显著差异，而低浓度下胚胎的刺激强度没有明显下降(P>0.05)(图5a))；丹皮酚、积雪草苷和原花青素在高浓度的给药组中，胚胎的刺激强度出现明显下降(P<0.000 1、P<0.001、P<0.000 1)，具有极显著差异(图5b)、c)、d))；4-叔丁基环己醇在各个浓度下，胚胎的刺激强度与模型组相比均无明显改变(P>0.05)(图5e))。

图5 5种化妆品原料对24 hpf斑马鱼胚胎刺激的舒缓功效Fig.5 Soothing efficacy of 5 cosmetic ingredients on zebrafish embryos

利用斑马鱼刺激模型对5种常见的化妆品舒缓原料的筛选结果表明，中、高浓度α-红没药醇对斑马鱼胚胎具有较好的舒缓功效，高浓度丹皮酚、积雪草苷和原花青素对斑马鱼胚胎具有较好的舒缓功效而4-叔丁基环己醇对斑马鱼胚胎不具有舒缓功效。其原因可能是4-叔丁基环己醇是环己醇类化合物，具有一定的麻醉作用[28]，会抑制斑马鱼胚胎本身的自旋运动，导致4-叔丁基环己醇的NOEC过低，在此模型中表现的舒缓效果不佳。

3 结论

本文以斑马鱼胚胎的自旋运动频率为指标，利用SDS作为造模剂构建斑马鱼刺激模型；分别采用该模型和传统斑马鱼炎症模型对甘草酸二钾和黄芩素的舒缓功效和抗炎作用进行评价，以验证斑马鱼刺激模型的可行性。同时利用斑马鱼刺激模型对α-红没药醇、丹皮酚、积雪草苷、原花青素和4-叔丁基环己醇5种原料进行舒缓功效的评价筛选。结果表明：SDS浓度500 μmol/L、对24 hpf斑马鱼胚胎作用时间15 min的斑马鱼刺激模型，刺激性最强且重复性较好；应用该模型评价甘草酸二钾和黄芩素的舒缓功效，与斑马鱼炎症模型的评价结果基本一致；α-红没药醇、丹皮酚、积雪草苷及原花青素在斑马鱼刺激模型中表现出一定的舒缓功效。本文建立的舒缓功效评价方法可通过斑马鱼胚胎行为学直观地反映化妆品原料的舒缓功效，为化妆品原料的开发和舒缓功效评价提供了一种较好的方法。而化妆品舒缓原料在斑马鱼胚胎模型中的作用机制是否与传统模型一致，目前尚不明确，还需进一步深入研究。