肺泡灌洗液二代测序在学龄儿童大叶性肺炎病原学诊断中的应用

何 敏，杨景龙，史瑞明，黄燕萍

(西安交通大学第一附属医院儿科，陕西 西安 710061)

大叶性肺炎是儿童下呼吸道感染性疾病中较常见的一种，临床起病急，病情重，病程长，易发生肺外并发症，近几年来发病呈逐渐增多的趋势[1]。肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌、流感嗜血杆菌是其感染的主要病原。传统的病原学诊断方法，例如咽拭子、痰培养、血清病原抗体检测、血培养等，尚不能满足临床快速、精准治疗的需求。宏基因二代测序(metagenomics next-generation sequencing，mNGS)可及时、准确地进行病原学检测，对指导临床诊断、治疗具有重要作用[2]。本研究应用电子纤维支气管镜对一组大叶性肺炎患儿行支气管肺泡灌洗，检测肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)中的病原情况，并对病原学和临床特征进行回顾性分析。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2019年8月至2020年2月在西安交通大学第一附属医院住院治疗的24例学龄期大叶性肺炎患儿为研究对象，按照是否采用肺泡灌洗液二代基因测序检测病原分为研究组和对照组各12例。纳入标准：①大叶性肺炎患儿的诊断标准参考诸福棠《实用儿科学》及儿童社区获得性肺炎诊疗规范[3-4]，患儿具有发热、咳嗽等表现，经听诊、胸片或CT、血常规检查确诊为大叶性肺炎；②本研究获得患儿家长的知情同意、我院医学伦理委员会的批准。排除标准：①伴有凝血功能疾病、贫血；②伴有肿瘤疾病；③支气管畸形；④气管异物；⑤长期应用免疫抑制剂、糖皮质激素的患儿；⑥因各种原因无法接受支气管肺泡灌洗。

1.2 研究方法

研究组采用传统方法及肺泡灌洗液二代基因测序检测病原，对照组只采用传统方法检测病原。具体为两组行支气管镜后采集肺泡灌洗液送检一般细菌培养，结核杆菌、真菌、细菌涂片，研究组在此基础上送检肺泡灌洗液mNGS。

支气管肺泡灌洗方法：参考国内儿科纤维支气管镜指南[5]，术前6 h禁食，选用Olympus BF260电子支气管镜，予以静脉镇静加局部麻醉的方法，采用2%利多卡因咽喉部局麻，纤维支气管镜经鼻、咽喉、声门进入气道，观察支气管形态，37℃生理盐水灌洗至炎症严重的肺段，1.0mL/kg至少灌洗3次，随即负压吸引以获取BALF，标本置一次性无菌硅化收集器中，缓慢拔出纤维支气管镜。操作过程中予以吸氧，常规监测血氧饱和度、血压和心率等，密切观察患儿呼吸、唇色、面色等情况。

研究组肺泡灌洗液mNGS检测方法：BALF外送至深圳华大基因股份有限公司，提取核酸后行PMseq病原微生物DNA高通量测序，测序所得的病原序列与病原库进行对比得到最终结果。报告致病菌的标准参考已有文献[6]。

此外，收集两组热程(发病至入院前)、影像学检查中肺炎病变部位等临床资料；收集两组红细胞沉降率(erythrocyte sedimentation rate，ESR)、C反应蛋白(C-reactive protein,CRP)、降钙素原(procalcitonin，PCT)、凝血功能、肺炎支原体抗体及病毒抗体检测等指标。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 两组一般资料及临床特征比较

两组患儿年龄、性别、肺炎范围比较，差异无统计学意义(P>0.05)；研究组热程较长，累及肺叶较多，差异有统计学意义(χ2/t值分别为5.716、6.972，P<0.05)，见表1。

表1 研究组与对照组一般资料及临床特征比较Table 1 Comparison of general data and clinical features of the children between the two

2.2 血清病原学检测

24例标本中血清肺炎支原体抗体(mycoplasma pneumonia，Mp)21例(87.5%)阳性，嗜肺军团菌抗体阳性5例(20.8%)，流感B型抗体阳性2例(8.3%)，合胞病毒抗体阳性1例(4.2%)，研究组与对照组的病原检出率比较差异无统计学意义(P>0.05)，见表2。

表2 研究组与对照组血清病原抗体检出率[n(%)]Table 2 Comparison of detection rates of pathogen antibodies in serum of the children between the two groups [n(%)]

2.3 肺泡灌洗液涂片及培养

24例患儿BALF细菌、结核、真菌涂片均阴性；对照组菌培养均阴性，研究组菌培养阳性2例(16.7%)，其中1例BALF培养为肺炎链球菌，1例痰培养及BALF培养均为耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistant staphylococcus aureus，MRSR)。

2.4 肺泡灌洗液mNGS

2.4.1 病原学分析

研究组肺泡灌洗液mNGS分析显示，5例单一肺炎支原体拷贝数阳性，其拷贝数为19 101～139 304，其余均为混合性感染，具体为EB病毒+肺炎支原体2例(16.7%)，格雷文尼放线菌+肺炎支原体2例(16.7%)，金黄色葡萄球菌+流感嗜血杆菌1例(8.3%)，微小微单胞菌+侵肺戴李斯特菌1例(8.3%)，细环病毒16型+肺炎支原体1例(8.3%)；1例金黄色葡萄球菌拷贝数519，肺泡灌洗液培养为MRSR；另有1例，肺泡灌洗液mNGS肺炎支原体阳性但肺泡灌洗液培养为肺炎链球菌，见表3。

2.4.2 肺炎支原体检出结果

研究组中1例患儿血清嗜肺军团菌IgM阳性，肺炎支原体抗体阴性而肺泡灌洗液mNGS显示肺炎支原体序列数阳性(37 769)；2例入院时肺炎支原体IgM、IgG定量正常(参考值分别为IgM<1.1，IgG<3.6)，同期肺泡灌洗液mNGS肺炎支原体序列数分别为120 363、20 276，治疗1周后复查肺炎支原体IgM、IgG定量均升高，IgM分别为3.6、5.1，IgG分别为145、320，但差异无统计学意义(P>0.05)。

表3 研究组检出病原类型Table 3 Pathogen types detected in the study group

2.4.3 病原序列数与临床指标的相关性分析

10例肺炎支原体感染患儿的序列数与CRP、ESR、住院时长有强正相关性(r值分别为0.891、0.861、0.814，P<0.05)，其中序列数最高的2例患儿临床诊断均为重症难治性支原体肺炎，故在一定程度上表明肺炎支原体载量越大，肺部病变越重，住院时间越长。

表4 10例肺泡灌洗液肺炎支原体序列数与临床指标的相关性分析Table 4 Correlations of sequence number of Mycoplasma pneumoniae in BALF with serological indexes and hospital stay in 10 children

3 讨论

3.1 微生物二代测序指导儿童肺炎病原学精准诊治

肺炎是儿童期常见的感染性疾病，在全球5岁以下导致儿童死亡的疾病中仍排第1位[7]。早期和快速精准判断病原微生物，针对性使用抗生素治疗，对于有效预防控制、临床诊治及改善预后具有十分重要的作用。传统微生物培养技术阳性率低，培养周期较长，而抗原/抗体的免疫学方法、病原体特异核酸序列PCR方法等，仅针对于已知病原，无法检测未知的病原。本研究病原血清学抗体检测仅提示肺炎支原体、嗜肺军团菌、流感病毒、合胞病毒感染，肺泡灌洗液病原学涂片均阴性，菌培养仅2例阳性，灵敏度较低。在热程及累及肺炎范围方面，研究组与对照组存在差异，原因可能与患儿发热时间越长、累及肺叶范围越广、病情越重，患儿家属对mNGS的接受程度越高，此外也与家庭经济状况、文化程度等社会因素有关，因此存在一定选择偏倚。

微生物宏基因二代测序技术具有准确性高、通量高的特点，无需微生物培养，直接提取标本核算测序，可检测样本中所有微生物信息，24～36 h即可判断病原，在敏感性及准确性方面与传统的病原检测技术差异均具有统计学意义，在临床医疗中发挥重要的作用[8-9]。有学者使用肺泡灌洗液二代基因测序34例儿童重症肺炎，检出病原32例，阳性率高达94.1%[10]。另有学者通过二代测序检测76例重症肺炎肺泡灌洗液，其灵敏度达86.84%，显著高于细菌培养、免疫荧光、定量PCR等传统检测技术[11]。Takeuchi等[12]研究也表明mNGS可用于呼吸道感染患者BALF中病原体的分子诊断和监测。柯创宏等[13]通过高通量测序检测43例婴幼儿重症或疑难细菌性肺炎的病原体灵敏度较高，并检测出经普通培养难以获得的鲍特菌，与本研究结果一致。

3.2 二代测序病原序列数与预后相关

近年来Mp感染发生率呈逐渐增高的趋势，本研究12例大叶性肺炎患儿mNGS检测BALF中也发现Mp为主要病原。自2012年全球多地区发生Mp暴发流行，日本、英国的感染病例也显著升高[14]。Mp是儿童社区获得性肺炎(communityacquired pneumonia，CAP)的重要病原体，可占CAP的10%～30%，Mp流行时可增加3～5倍[15]。由于Mp对大环内酯类药物耐药等一系列复杂的机制使得难治性肺炎支原体肺炎的发病率增高，常引起肺不张、肺坏死、支气管扩张及闭塞性细支气管炎等不良预后和后遗症，因此，早诊断、早治疗是Mp感染诊治的关键。本研究2例入院时肺炎支原体抗体IgM、IgG均正常，而肺泡灌洗液Mp序列数均升高，治疗1周后复测肺炎支原体IgM、IgG阳性，表明mNGS可以更早的发现Mp。另外，10例支原体肺炎患儿的Mp序列数与CRP、ESR、住院时长有强相关性，其中序列数最高的2例患儿临床诊断均为重症难治性支原体肺炎，肺部实变范围广，临床症状重，住院时间明显延长。

3.3 病原微生物二代测序的局限性

众多研究证明mNGS能够快速、准确地检测和鉴定病原体[16-17]，但是仍然存在一些局限性。首先，由于病变的位置和患者的耐受性，通过支气管镜检查获得的标本可能不含有价值的病原体DNA，继而会导致结果假阴性。在以后的研究中应开发标准化程序以进一步提高mNGS的检测产出率。其次，由于真菌和细菌的细胞壁较厚，在DNA提取过程中采用了破壁处理，这可能会影响RNA病毒的检测。因此，如果怀疑RNA病毒感染，应采用RNA提取和逆转录程序。此外，mNGS无法区分定植和致病菌株，检测结果需结合患儿临床特征、实验室检查、影像学结果综合分析。最后，经济成本也是限制二代测序技术推广的重要因素。mNGS的平均成本为每份标本3 000元左右，与传统的病原体检测相比经济负担较大，相信随着科技的发展，未来二代测序检测病原体的成本将很快逼近甚至低于血培养等传统检测技术，推动其临床应用。

综上，mNGS可提高儿童大叶性肺炎的病原诊断准确率，对临床治疗有指导作用。但本研究是单中心回顾性研究，仍需要更多前瞻性和多中心数据进一步验证mNGS分析的准确性，实现精准诊疗。