血清细胞角蛋白-18水平与经磁共振成像质子密度脂肪分数量化的肝脏脂肪变性程度的相关性

胡盛龙 赵莉 庄立琨 刘守胜 辛永宁 宣世英

青岛大学附属青岛市市立医院1感染性疾病科（山东青岛266011），2临床研究中心（山东青岛 266071）；3青岛市平度市疾病预防控制中心质量管理科（山东青岛 266700）

非酒精性脂肪性肝病（non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）是全球常见的慢性肝病之一［1］。目前全球NAFLD 患病率为25%，而中国患病率为22.4% ～43.65%［1-2］。随着中国城镇化速度的加快、人口老龄化的加剧，国内NAFLD 患病率持续增长。据统计到2030年，中国将成为NAFLD 患病率在全球内增幅最大的国家，给中国居民健康、医疗与经济带来重大影响和负担［3］。

目前肝活检是诊断和评估NAFLD 发生发展的金标准，但因其具有侵入性、潜在并发症、取样误差及接受度不高等缺陷，难以用于疾病的筛查与监测［4］。近些年，许多研究表明血清标志物具有诊断NAFLD 或非酒精性脂肪性肝炎（NASH）的潜能，其中包括血清细胞角蛋白18（cytokeratin-18，CK-18）。CK-18 是肝脏中主要的中间丝蛋白，来自半胱天冬酶3 介导的肝细胞凋亡［5］。此前已有研究［6-7］证实肝细胞凋亡与NASH 密切相关，CK-18水平在NASH 患者中明显增加。此后，也有多项研究［8-9］表明CK-18水平与组织学改变相关。然而，另有研究［10-11］表明，CK-18 不足以区分单纯脂肪变性与NASH 患者，与肝脏组织学改变无相关性，且有研究［12］表明CK-18 不是NAFLD 的独立 危险因素。先前研究中，NAFLD患者的诊断方式多为超声诊断，由于超声诊断NAFLD 的准确性不高，导致不同研究之间的结果存在不一致现象。磁共振成像质子密度脂肪分数（magnetic resonance imaging proton density fat fraction，MRI-PDFF）能够通过分析整个肝脏的脂肪含量，无创地定量肝脏脂肪变性程度以及脂肪变性的变化，被认为是检测NAFLD 患者肝脏脂肪变性的金标准［13］，尤其在对肝脏脂肪含量进行定量评估上比组织学诊断更为灵敏［14］。在本研究中，以MRI-PDFF 为肝脏脂肪变性的参考标准，评估血清CK-18 M30、CK-18 M65在检测肝脂肪变性中的诊断价值。

1 对象与方法

1.1 研究对象 本研究符合赫尔辛基宣言并经青岛市市立医院医学伦理委员会批准（临床试验注册编号：ChiCTR1900022744）。在2019年2月至2020年1月期间，招募在青岛市市立医院就诊的NAFLD 患者为NAFLD 组，以及同期本院体检中心的健康体检者为健康对照组，所有受试者均已详细知晓研究目的及内容并签署知情同意书。根据AASID 指南，排除酒精性脂肪性肝病（女性为每周140 g 酒精，男性为每周210 g 酒精）、病毒性肝炎、全胃肠外营养、肝豆状核变性、自身免疫性肝病等可导致脂肪肝的特定疾病［13］。通过调查问卷的方式获取所有受试者的性别、年龄、既往史与合并疾病（高血压、糖尿病和血脂异常等），以及人体测量指标。体质量指数（BMI）计算为体质量（kg）除以身高（m）的平方（kg/m2）。根据诊断标准定义代谢综合征［15］。

1.2 生化指标检测 抽取每位受试者空腹静脉血，检测丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天门冬氨酸氨基转移酶（AST）、总胆固醇（TC）、谷氨酰转肽酶（GGT）、碱性磷酸酶（ALP）、油三酯（TG）、高密度脂蛋白（HDL）、低密度脂蛋白（LDL）、尿酸（UA）、糖化血红蛋白（HbA1c）、空腹血糖（FBG）、空腹胰岛素（FINS）等指标。采用CK-18 M30 与M65 酶联免疫吸附试验（ELISA）试剂盒（中国江苏和锐生物科技有限公司）分别检测受试者血清中CK-18 M30与M65 的含量。

1.3 MRI-PDFF 检测及数据处理 所有受试者均在青岛市市立医院医学影像科行MRI-PDFF 检查，采用3.0-TMRI 扫描仪（Ingenia，PhilipsHealthcare，Best）行肝脏MRmDixon-Quant 检查。MRI 的采集方法见参考文献［16］。根据MRI-PDFF 值对受试者进行分组：健康对照组（S0）：0% ＜MRI-PDFF 值＜6.4%，轻度脂肪变性（S1）：6.4% ≤MRI-PDFF 值＜17.4%，中重度脂肪变性（S2 & S3）：MRI-PDFF值≥17.4%［16］。

1.4 统计学方法 本研究所有数据利用SPSS 26.0 统计学软件进行分析。计量资料以（）表示，分别采用曼-惠特尼U检验与Kruskal Wallis 秩和检验进行两组间及多组间的比较。计数资料以例数和百分数表示，比较用χ2检验。使用Pearson相关系数分析计算参数与肝脂肪变性等级之间的相关程度。使用受试者工作特征曲线下面积（AUC）分析评估用于检测肝脂肪变性的变量的预测值。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 受试者一般资料和临床指标比较 本研究共纳入120 例受试者，其中包括40 例健康对照者，80例NAFLD 患者。与健康对照组相比，NAFLD 组男性患者比例更高，且患有代谢综合征和血脂异常的比例显著升高（均P＜0.05），见表1。

表1 所有受试者基本资料和临床信息Tab.1 Basic data and clinical information ofsubjects例（%）

根据MRI-PDFF 值将NAFLD 患者分为S1 组和S2 & S3 组。健康对照组、S1 组和S2 & S3 组3 组。BMI、腰围、ALT、AST、UA、TC、TG、LDL 和FINS 水平差异有统计学意义（均P＜0.05），并且随着肝脏脂肪变性程度加重而逐渐升高。ALP、GGT、HDL和FBG 在3 组中的含量差异有统计学意义（均P＜0.05），但在S1 组与S2&S3 组中，其含量差异无统 计学意义（P＞0.05）。见表2。

表2 所有受试者一般生化指标特征Tab.2 Biochemical characteristics of all subjects M（P25，P75）

利用Pearson 相关系数分析临床指标与MRIPDFF 评估的肝脏脂肪变性程度之间的相关性。肝脏脂肪变性程度与BMI、腰围、ALT、AST、GGT、UA、TG、HDL和FINS具有中度相关性（均|r|＞0.3，均P＜0.001），与TC 相关性较差（|r|≤0.3，P＜0.05），而与TC、LDL、FBG、HbA1c 无明显相关性（均|r|≤0.3，均P＞0.05）。见表3。

2.2 CK-18 M30和M65与肝脏脂肪变性程度的相关性 利用ELISA方法对所有受试者血清中CK-18 M30 和M65 的水平进行测定。CK-18 M30 在3 组中的水平差异有统计学意义（P= 0.018）。其中S2 &S3 组中CK-18 M30 的水平较健康对照组和S1 组均有明显升高（均P＜0.05），但在S1 组和健康对照组之间差异无统计学意义，见图1。利用Pearson相关系数分析了CK-18 M30的水平与肝脏脂肪变性程度的相关性，结果显示CK-18 M30 的水平与肝脏脂肪变性程度呈正相关（r= 0.404，P＜0.001）。CK-18 M65 在3 组中的水平差异均无统计学意义（P=0.163），并且CK-18 M65 的水平与肝脏脂肪变性程度无显著相关性（r=0.119，P=0.196），见图1、2 和表3。

表3 受试者生化指标与肝脏脂肪变性程度的相关性Tab.3 Correlation between biochemical indexes and liver steatosis in all subjects

图1 血清CK-18 在经MRI-PDFF 诊断不同肝脏脂肪变性组中的分布Fig.1 Distribution of serum CK-18 in different groups of hepatic steatosis diagnosed by MRI-PDFF

对所有受试者进行线性回归分析，通过单因素线性回归分析，MRI-PDFF 测定的肝脏脂肪含量与血清CK-18 M30水平、BMI、腰围、ALT、AST、UA、TG 和FINS 存在线性相关，随后进一步行多元回归分析显示MRI-PDFF 测定的肝脏脂肪含量与血清CK-18 M30 水平和BMI 独立相关，见表4。

图2 血清CK-18 水平与MRI-PDFF 值的相关性分析Fig.2 Correlation between serum CK-18 and MRI-PDFF

表4 中重度肝脂肪变性相关因素的线性回归分析Tab.4 Linear regression analysis of related factors in moderate&severe hepatic steatosis

2.3 血清CK-18 M30 对肝脏脂肪变性等级的预测价值 利用ROC 评估血清CK-18 M30 诊断肝脏脂肪变性等级的价值。以100.4 U/L 作为CK-18 M30诊断S ≥1 的最佳截断值，其AUC 值为0.611，敏感性为53.75%，特异性为72.5%；以118.9 U/L作为CK-18 M30 诊断S ≥2 的最佳截断值，其AUC 值为0.666，敏感性及特异性分别为60.71%和79.35%。见图3。

图3 血清CK-18 M30 诊断肝脏脂肪变性的ROC 曲线Fig.3 ROC curve of serum CK-18 M30 in the diagnosis of hepatic steatosis

2.4 影响CK-18 M30 的相关因素分析 利用单因素线性回归分析了影响CK-18M30 水平的相关因素。ALT、AST、GGT、FINS、MRI-PDFF 值与血清CK-18 M30 水平相关。但在多元线性回归分析中，仅有AST、MRI-PDFF 值与CK-18 M30 独立相关。见表5。

表5 血清CK-18 M30 相关因素的线性回归分析Tab.5 Linear regression analysis of related factors of serum CK-18 M30

3 讨论

肝脏脂肪变性是NAFLD 的关键特征，MRIPDFF 是肝脏脂肪变性的非侵入性生物标志物。研究［17］证明，在检测NAFLD 患者肝脏脂肪变性方面比肝脏瞬时弹性成像更准确，并且在量化肝脂肪含量的变化方面比组织学分级更敏感［14］。细胞凋亡决定着疾病的活动与进展，当肝脏脂肪变性引起细胞凋亡速度加快时，CK-18 被半胱天冬酶分解，形成CK-18 片段，能被M30 抗体识别；当肝脏受损程度严重时，大量肝细胞死亡，部分CK-18 来不及被酶切割而直接释放到血液中，形成CK-18 全长蛋白，能被M65 抗体识别［5］。本研究采用ELISA方法对所有受试者血清中CK-18 M30 和M65 进行定量检测，并分析其与经MRI-PDFF 量化的肝脏脂肪变性程度的相关性。

血清CK-18 M30 水平在健康对照组、S1 组和S2&S3 组中具有明显的差异，且血清CK-18 M30 水平与经MRI-PDFF量化的肝脏脂肪变性程度呈正相关性，这一结果与多项研究的结果相同［9-10，18-19］。FELDSTEIN 等［9，19］分别在儿童及成人中证实，血清CK-18 M30 水平与经肝活检评估的肝脏脂肪变性程度呈正相关。CUSI 等［10］也证实血清CK-18 M30水平与经磁共振波谱和肝活检定量的肝脂肪变性均有相关性。近期的研究［20］也表明随着MRI 评估的肝脂肪含量的增加，血清CK-18 M30 水平显著增加。国内的研究［21］也发现血清CK-18 M30水平在NAFLD患者中显著升高。这些都与本研究所得出的结果一致，进一步说明血清CK-18 M30 水平与肝脏脂肪变性程度显著相关，且具有一定的诊断价值。CK-18 M30 在不同环境、种族及疾病复杂性中的诊断准确性不尽相同。因此，本研究分析了影响中重度肝脂肪变性的相关因素，多元线性回归显示血清CK-18 M30 水平与中重度肝脂肪变性独立相关。相对于轻度肝脂肪变性，中重度肝脂肪变性加重了肝细胞损伤，这也表明CK-18 M30 水平的升高与NAFLD疾病进展相关。此外，本研究还发现血清CK-18 M30 水平仅与AST、MRI-PDFF 值独立相关，与之前CUSI 等［10］的研究相同。提示CK-18 不易受年龄、性别、肥胖、血脂异常等混杂因素的影响，突出了CK-18 在临床中作为NAFLD 诊断与疾病监测无创标志物的优势。

在本研究中，未发现血清CK-18 M65 水平与肝脏脂肪变性存在明显相关性。结果可能受限于本研究中中重度肝脂肪变性的人群较少。CK-18 M65 的研究相对较少，且多项研究［22-23］结果显示CK-18 M65 与肝纤维化严重程度密切相关。本研究未涉及NASH 及肝纤维化的评估，无法分析CK-18 M65 水平与NASH、肝纤维化的相关性。

本研究尚存在局限性。首先，本研究未从组织学上对参与者进行肝脏脂肪变性诊断。其次，本研究纳入中重度肝脏脂肪变性患者较少。最后，本研究的研究对象是中国汉族人群，研究结果需在其他群体中进一步验证。

血清CK-18 M30 在肝脏脂肪变性患者中水平升高，与肝脏脂肪变性程度呈正相关，表明NAFLD患者CK-18 M30 水平与肝脏脂肪变性加重相关。本研究未发现血清CK-18 M65 水平与肝脏脂肪变性之间的相关性。未来需要在多中心及更大样本量中进一步研究CK-18 在NAFLD 发生发展中的生物标志物的价值。