反复种植失败的子宫内膜异位症患者冻融胚胎移植结局的影响因素

陈曼 夏汝斌 林虹 李志凌

汕头大学医学院第一附属医院生殖医学科（广东汕头 515041）

近年来辅助生殖技术（assisted reproductive technology，ART）快速发展，但反复种植失败（repeated implantationfailure，RIF）的发生率高达5%～10%［1］，成为影响辅助生殖技术成功率的重要制约因素之一。RIF 的原因复杂且涉及多个方面，子宫内膜异位症（endometriosis，EMS，简称内异症）可导致胚胎种植率下降［2］，也是导致RIF 的因素之一，因而，对于发生RIF 的内异症患者，如何改善内膜容受性是获得理想妊娠结局的关键。目前国内外研究［3-4］多认为IVF-ET 前使用促性腺激素释放激素激动剂（gonadotropin-releasing hormone agonist，GnRH-a）预处理有助于提高内异症患者的临床妊娠率，那么，对于RIF 的内异症患者，冻融胚胎移植（frozen-thawed embryo transfer，TET）前采用GnRH-a 预处理是否可以提高子宫内膜容受性、改善临床结局，目前国内外相关报道较少。本文回顾性分析了本院近5年内异症患者TET 相关资料，旨在探索RIF 的内异症患者的可能影响因素及最佳治疗方案，以帮助患者尽快获得临床妊娠。

1 资料与方法

1.1 研究对象 回顾性分析2016-2020年在汕头大学医学院第一附属医院接受冻融胚胎移植治疗的81 周期内异症相关不孕患者的临床资料。入选标准：结合病史、体征及辅助检查（影像学检查及血清CA125）临床诊断或手术诊断为内异症；年龄＜40 岁；胚胎移植次数≥3 次。排除标准：（1）子宫发育异常（如双子宫、双角子宫、单角子宫、子宫中隔等）、甲状腺功能异常、高泌乳素血症等；（2）夫妇双方任意一方染色体异常；（3）既往不良孕史：自然流产史（≥2）、死产史、死胎史、胎儿畸形史等；（4）年龄≥40 岁。符合以上剔除指标任一条则不入选该研究。本研究通过医院伦理委员会批准同意。

1.2 研究方法 胚胎冻融患者的控制性超促排卵（controlled-ovarian stimulation，COS）周期中，根据患者年龄、不孕因素及卵巢储备情况，选用不同的COS 方案，当2 ～3 个主导卵泡直径达到18 mm，平均每成熟卵泡E2水平为200 ～300 pg/mL 时，当日白天继续或停止促性腺激素，当晚注射绒促性素（human chorionic gonadotropin，hCG，丽珠）5 000～10 000 IU 或重组人绒促性素（recombinant hCG，r-hCG，默克雪兰诺）250 μg，36 ～38 h 后取卵；对于拮抗剂方案促排者，如果出现多个卵泡发育，有OHSS 高风险时，采用短效GnRH-a（醋酸曲普瑞林，益普生）0.1 ～0.2 mg，或GnRH-a 0.1 mg 联合小剂量hCG 诱导卵泡成熟，扳机后34 ～36 h 后取卵，取卵后根据患者情况进行IVF/ICSI。取卵后第3天或第5 天视情况（COS 方案、OHSS 风险、内膜情况等）行胚胎移植或全胚冷冻。常规冷冻4 ～6 枚卵裂期胚胎，优先冷冻优质胚胎，剩余胚胎行囊胚培养，本研究中所有囊胚均为非优质卵裂期胚胎来源。胚胎采用玻璃化冷冻法，试剂盒及冷冻载杆（日本加藤公司）使用方法按说明书进行，胚胎复苏后培养2 h。

1.3 根据内膜准备方案分组 临床上根据患者病史、既往移植周期内膜准备方案、剩余冷冻胚胎质量、子宫大小及CA125 水平选择不同子宫内膜准备方案。根据内膜准备方案的不同，分为4 组，比较各组患者平均年龄、体质量指数（body mass index，BMI）、平均移植次数、内膜厚度、移植胚胎数、优胚率、临床妊娠率、胚胎种植率、早期流产率、多胎率及异位妊娠率等。

1.3.1 自然周期组（NC组）月经第10-11天开始进行B超监测卵泡及内膜，当优势卵泡直径＞13 mm时，监测尿黄体生成素（LH）q6～8 h，尿LH 阳性则抽血检测LH、雌二醇（E2）和孕酮（P）水平，当血LH ＞20 mIU/mL，认为出现血LH 峰，予注射r-hCG 250 μg/hCG 6 000 ～10 000 IU，以血LH 峰出现当天为0 d，选择胚胎移植的时间，若解冻D3 冷冻的胚胎，则在血LH 峰+4 d 进行冻融胚胎移植，若解冻D5/6 冷冻的囊胚，则于血LH 峰+6 d 进行冻融囊胚移植。排卵后给予地屈孕酮（达芙通，10 mg，荷兰Abbott Biologicals B.V.）进行黄体支持10 mg/次，2 ～3 次/d，至验孕日。

1.3.2 诱发排卵组（OI 组）月经第2- 5 天开始口服来曲唑片（芙瑞，江苏恒瑞医药），根据患者的年龄、体质指数、卵巢储备功能评估及卵巢反应，必要时添加尿促性素（HMG，宁波人健药业集团股份有限公司），B 超监测卵泡及内膜、诱发排卵、排卵后胚胎移植时间及黄体支持方案同NC 组。

1.3.3 激素替代组（HRT 组）月经第2- 5 天开始口服雌激素，采用递增方案，雌激素起始剂量为2 ～4 mg/d，4 ～7 d 后根据血E2水平及内膜厚度、类型及生长速度，必要时调整剂量，当子宫内膜厚度≥8 mm、血E2≥100 ～200 pg/mL 时，加孕激素转化内膜：口服地屈孕酮20 ～40 mg/d，和（或）阴道用雪诺酮90 mg/d（默克雪兰诺），和（或）肌注黄体酮20 ～40 mg/d，若解冻D3 冷冻的胚胎，于内膜转化的第3 天行冻融胚胎移植，若解冻D5/6 冷冻的囊胚，则于第5 天行冻融囊胚移植。移植后继续维持雌激素及孕激素，如宫内妊娠，孕9 周开始逐渐减量至孕12 周停药。

1.3.4 降调后激素替代组（降调HRT 组） 于月经第2- 5 天予注射长效GnRH-a（醋酸曲普瑞林，益普生）3.75 mg，4周后检测血LH ≤5 mIU/mL，FSH ≤5 mIU/mL，E2≤50 pg/mL，P≤1 ng/mL，子宫内膜厚度≤5 mm 时开始雌激素递增方案，激素补充、内膜转化、胚胎移植时间及黄体支持方案同HRT 组。

1.4 根据进行IVF 助孕治疗前是否经过手术治疗分组 分为内异症术前组和内异症术后组，比较两组临床妊娠率。

妊娠判断：胚胎移植14 d（囊胚移植后12 d），测定血β-hCG，如β-hCG ＜50 mIU/mL，停黄体支持药物，1 周后复查β-hCG，同时密切观察腹痛及阴道出血情况，不适随诊；如β-hCG ≥50 mIU/mL，确定为生化妊娠，继续给予黄体支持；并于2 d 后、1 周后（必要时）查血清β-hCG 上升情况。胚胎移植后4 ～5 周左右行第1 次B 超检查检查胎儿数、胎心搏动及胚胎着床部位。

1.5 统计学方法 采用SPSS 25.0进行统计学分析。采用二分类logistic 回归分析影响临床妊娠率的相关因素；样本计量资料间的比较采用t检验，多样本均数比较采用单因素方差分析（One-way ANOVA），若方差齐性，采用LSD 法进一步行两两比较，若方差不齐，采用Dunnett′s T3 法；计数资料用率表示，率的比较采用χ2检验。P＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 临床妊娠结局的影响因素分析 通过二分类logistic 回归分析显示，移植胚胎数及移植胚胎类型是影响临床妊娠结局的因素（P＜0.05），而年龄、BMI、指征、内膜准备方案、转化日E2水平、转化日P 水平、转化日内膜厚度及移植胚胎类型并不是影响临床妊娠率的影响因素（P＞0.05，表1）。对移植胚胎数进行ROC 曲线分析得出移植胚胎数的曲线下面积为0.586，cut off 值为2.5 枚（图1）。进行IVF/ICSI 助孕治疗前是否经过手术治疗的临床妊娠率差异无统计学意义（P＞0.05，表2）。

表2 内异症术前组及术后组两组间临床妊娠率的比较Tab.2 Comparison of the clinical pregnancy rate between the preoperative and postoperative groups of endometriosis

图1 移植胚胎数的ROC 曲线Fig.1 ROC curve of the number of embryo transferred

表1 影响RIF 的内异症相关不孕患者临床妊娠结局的二分类logistic 分析Tab.1 Logistic analysis of factors Affecting clinical pregnancy outcomes in infertility patients with endometriosis and RIF

2.2 不同胚胎质量胚胎种植率的比较 根据移植胚胎质量比较胚胎着床率，结果见图2，移植囊胚的胚胎着床率最高，差异有统计学意义（P=0.018）。

图2 不同胚胎质量胚胎着床率的比较Fig.2 Comparison of embryo implantation rate with different embryo quality

2.3 不同内膜准备方案组患者一般情况及妊娠结局的比较 OI 组仅2 个周期行冻融胚胎移植，均未获得临床妊娠，因例数过少不纳入组间比较，结果发现（表3）：三组间的平均年龄、移植次数、内膜厚度等患者基线资料差异无统计学意义（P＞0.05）。HRT 组的平均移植胚胎数较NC 组明显增加（P＜0.05），而临床妊娠率及胚胎种植率高于NC 组及降调HRT 组，但差异无统计学意义（P＞0.05）；各组间的多胎率、早期流产率及异位妊娠率等比较差异均无统计学意义（P＞0.05）。根据移植胚胎类型不同，分别比较三组间的优胚率及临床妊娠率，差异无统计学意义（P＞0.05）。

表3 不同内膜准备方案组间患者一般情况及临床结局的比较Tab.3 Comparison of patients′general situation and clinical outcome between different endometrial preparation groups

3 讨论

反复种植失败是目前辅助生殖领域研究的热点和难点，但关于RIF 的定义目前尚无统一标准，目前国内外较为公认的是：40 岁以下的女性，经历3 次以上胚胎移植周期，且累积移植至少4 枚卵裂期优质胚胎或者3 枚优质囊胚而未能获得临床妊娠［5］。胚胎种植的分子机制尚未阐明，其原因复杂且涉及多个方面，其中包括了两个关键因素：胚胎质量、子宫内膜容受性及两者的相互作用，对于RIF 患者而言，在多次移植优质胚胎失败后，如何提高子宫内膜容受性则成为提高临床妊娠率的关键，因此，选择合适的内膜准备方案尤其重要。目前TET 的内膜准备方案主要包括自然周期、促排卵周期、激素替代周期或降调激素替代周期。NC方案子宫内膜的发育由内源性激素调控，更符合生理状态，但监测频繁、不能灵活安排时间。OI 方案主要作为不适宜使用HRT 方案的排卵障碍患者的备选方案。HRT 和降调HRT 方案通过周期使用外源性雌、孕激素，调控子宫内膜的生长，具有复诊少、工作计划性强等优点，但也存在患者对外源性激素反应不良、用药量大、用药时间长等缺点［6］。临床上常根据患者病史、不孕因素、既往移植周期内膜准备方案、剩余冷冻胚胎质量等选择不同子宫内膜准备方案。对内异症患者，我科倾向于首选降调HRT 方案进行内膜准备。主要是因为GnRH-a 可下调垂体功能，促性腺激素的分泌下降，抑制卵巢活性，降低雌激素的分泌，降低盆腔微环境炎性因子水平，而内异症为雌激素依赖性疾病，GnRH-a 通过抑制卵巢功能使内异灶萎缩，提高内膜容受性，有利于卵泡发育及胚胎种植，从而成为临床上内异症药物治疗的“金标准”。国内外研究结果也显示［7-8］GnRH-a 预处理组可提高子宫腺肌病（不孕）患者冻融胚胎移植的妊娠结局，国内专家意见［9］也认为GnRH-a 预处理可以使内异症不孕患者在接受IVF治疗时受益。而对RIF患者，也有研究［10-11］认为GnRH-a 预处理可改善RIF患者冻融胚胎移植的临床妊娠率和胚胎着床率，但目前尚存在争议。当内异症不孕患者在IVF 治疗过程发生RIF，治疗难度将大幅增加，成为临床医师面临的极为棘手的问题。考虑GnRH-a 在内异症治疗的优势及RIF 的可能受益作用，采用降调HRT 方案较其他内膜准备方案能否改善临床结局，目前国内外未见相关报道。

在苏琼等［12］的研究中，冻融卵裂期胚胎移植和冻融囊胚移植的两组患者在降调激素替代组和激素替代组之间的临床结局差异均没有统计学意义，DAVAR 等［13］比较RIF 患者TET 周期内膜准备方案，亦发现降调HRT 组与HRT 组的临床妊娠率与胚胎种植率差异无统计学意义。本研究通过比较各内膜准备方案的患者一般资料及临床治疗结局，发现无论移植卵裂期胚胎还是囊胚期胚胎，降调HRT 并不能提高RIF 的内异症患者TET 周期的临床妊娠率及胚胎种植率，结果与上述作者观点一致。在本研究中，HRT 组的临床妊娠率和胚胎种植率较其他两组有升高的趋势，可能原因：（1）本研究对象为RIF 的子宫内膜异位症患者，样本数偏少，需要更大样本进一步证实；（2）虽然本研究中HRT 组卵裂期胚胎的优胚率低于NC 组和降调HRT 组，但移植胚胎数高于NC 组，结合logistic 回归分析结果，移植胚胎数的增加可能是HRT组妊娠结局提高的原因之一。虽然在辅助生殖助孕过程中减少移植胚胎数目是降低多胎妊娠的最有效措施，但对于RIF 的内异症患者，可根据患者病情个体化调整移植策略，必要时适当增加移植胚胎数目以提高临床妊娠率。

在RIF 患者中，移植胚胎质量也是另一个需要关注的重点，本研究通过logistic 回归分析筛选出移植胚胎类型为影响RIF 的内异症患者TET 临床妊娠结局的影响因素之一，并且NC 组、HRT 组和降调HRT 组的早期流产率分别为25.0%、0 和30.8%，总体早期流产率偏高。进一步分析发现，本研究中的卵裂期胚胎优胚率不高、囊胚均来自非优质卵裂期胚胎。周敏等［14］发现子宫内膜异位症不孕患者行IVF/ICSI 受精率及优胚率降低且流产率升高，提示内异症可影响胚胎质量，与本研究结果一致。BOYNUKALIN 等［15］认为内异症主要影响了胚胎早期形态动力学事件及细胞周期的持续时间，进一步揭示了内异症影响胚胎质量的机制。本研究中优胚率偏低，也不排除与前期多次移植、优质胚胎消耗有关。尽管如此，本研究中囊胚的种植率仍显著高于卵裂期优质胚胎，而不同质量卵裂期胚胎组合的胚胎种植率无显著性差异。张庆等［16］研究结果亦提示卵裂期胚胎的形态学评级对临床妊娠率及活产率等妊娠结局的影响不大，提示对于卵裂期非优质胚胎可进行囊胚培养，最终形成的囊胚具有临床应用价值。

对于行IVF 的EMS 患者，IVF 前是否手术是生殖医生非常关注的问题。回顾性研究证实IVF 前完整切除异位病灶能明显提高胚胎种植率、妊娠率及活产率［17］。IVF 前剥除卵巢子宫内膜囊肿能够预防囊肿破裂，有利于取卵，避免卵泡液污染，阻止疾病进展，且能排除恶性可能［18］，但手术有损伤风险、存在并发症、增加经济负担、可能降低卵巢反应性、且目前尚无证据证实IVF 前手术可以提高妊娠率［19］。研究结果显示IVF/ICSI 前是否经过手术治疗对内异症患者TET 的临床结局没有影响，虽然手术可消除内异症病灶、解除粘连，但一项回顾性病例对照研究［20］发现，与输卵管因素不育的患者相比，EMS 并不影响IVF 的结局；腹腔镜切除内异症病灶后也并不改善IVF 的结局。另有研究［21］显示，对于EMS，无论是手术治疗（囊肿剔除或穿刺）、药物治疗、手术及药物联合治疗，还是保守观察，都不影响ART 的临床妊娠率。

综上所述，移植胚胎数及移植胚胎类型是RIF的内异症患者行冻融胚胎移植结局的影响因素，不同内膜准备方案临床妊娠结局相当。RIF 的内异症患者TET 内膜准备方案的选择应根据既往内膜准备方案及患者的临床特点等因素综合考虑，必要时可适当增加移植胚胎数目或选择移植囊胚以提高临床妊娠率。但由于本研究属于回顾性研究，且样本量少，还需在今后的工作中进行大样本量的前瞻性深入研究以进一步验证。