过表达EphB6与BRAFi在抑制黑素瘤转移中的协同作用

刘 娜 李 品 王齐霞 李明明 黄淑红 党宁宁

1潍坊医学院，潍坊，261000；2山东第一医科大学附属济南市中心医院，济南，251003；3山东第一医科大学(山东省医学科学院)医学科技创新中心，济南，250117；4山东第一医科大学(山东省医学科学院)基础医学院，济南，250117；5山东第一医科大学附属省立医院，济南，250021

转移性黑素瘤的预后很差，五年生存率<25%[1]，直到近年来才出现有限的治疗选择[2]。基因组测序结果显示，黑素瘤比其他实体肿瘤具有更高的突变性[3]。BRAF激酶编码基因突变占黑素瘤发生的40%～60%，且最常见的致癌突变基因为V600E[3]。维莫非尼是一种竞争性激酶抑制剂，对具有V600E等突变的BRAF激酶具有活性，它通过与突变BRAF的ATP结合结构域结合来发挥其功能；而达帕非尼是一种可逆的ATP竞争性激酶抑制剂，靶向MAPK途径。二者均可以有效抑制V600E突变的BRAF蛋白[4]。尽管延长黑素瘤患者无进展生存期和总生存期的方法已经出现，但有效率却存在很大差异。患者对抑制剂产生耐药性可能是造成这些差异的原因[7]，而有研究显示，人类Eph受体家族可能与这种耐药性的产生有关。

人类Eph受体家族目前有14个成员，它们构成最大的受体酪氨酸激酶家族[8]。这些Eph受体及其ephrin配体参与了多种发育功能，包括脊椎动物的后脑发育、组织发育和血管生成[9]。过表达Eph受体及其Ephrin配体的各种成员在癌症中经常被报道。相比之下，另一种激酶缺陷受体EphB6在黑素瘤[11]、乳腺癌和前列腺癌[12]等最具侵袭性的细胞系中表达下调，这表明EphB6与其他家族成员相比具有独特的作用。

本研究将揭示过表达EphB6和BRAF抑制剂(BRAFi)在侵袭性黑素瘤细胞增殖和侵袭中的协同作用。

1 材料与方法

1.1 数据库分析 GSE141484是7个与BRAFi治疗前后相匹配的黑素瘤组织的基因表达谱。GSE22838是对6例BRAF野生型和5例BRAF突变型黑素瘤患者的基因表达分析。基于log2(Fold变化)>1或<-1，及双尾T检验P值<0.05，对差异表达基因进行筛选。维莫非尼的316个基因和达帕非尼的330个基因从Pubchem数据库(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)下载。

1.2 细胞培养与处理 从ATCC(马纳萨斯，VA，USA)获得375和1205Lu细胞(BRAFV600E突变，无NRAS突变)，用含10%胎牛血清和1% Pen/Strep的DMEM高糖(HyCloneSH30243.01)在37℃和5%二氧化碳的培养箱中培养。将EphB6cDNA克隆到pcDNA3.1质粒中，用Lipo2000试剂转染细胞。维莫非尼(10μM)和达帕非尼(1μM)购自Selleck.cn。

1.3 蛋白免疫印迹分析 使用含有混合蛋白酶抑制剂的RIPA缓冲液裂解细胞。裂解液在冰下孵育10分钟，接着在4℃，12 000 g的条件下离心10 min。采用BCA法测定每个样品的蛋白浓度。样品装载在SDS-PAGE上。电泳后，将蛋白质从凝胶转移到PVDF膜上。在含5%脱脂牛奶的TBST中封闭膜1 h，然后与一抗 (抗EphB6、PA5-115191、Anti-GAPDH、ab8245、Abcam) 孵育过夜。通过ECL Plus系统 (Tanon，中国) 观察免疫反应条带。

1.4 CCK-8分析 分别将2个过表达EphB6的细胞接种于96孔板中，每孔接种2×103个细胞并培养24 h。加入10 μM维莫非尼或1 μM达帕非尼，培养24 h。随后，去除培养基，加入10%的CCK-8试剂孵育2 h。使用自动平板阅读器读取每孔在450 nm处的吸光度(OD)值，并计算孵育0 h和48 h时OD值的倍数变化。

1.5 克隆形成分析 分别将过表达EphB6的细胞以1×103的数量接种于6孔板的每孔中培养2周。随后，去除培养基，用4%多聚甲醛固定细胞，然后用0.2%结晶紫染色并计数。

1.6 Transwell分析 在饥饿4 h后，将过表达EphB6的细胞以1×105的数量接种于200 μL无血清培养基的基质胶涂层膜上孵育12 h。在培养基中加入10 μM维莫非尼或1 μM达帕非尼。用PBS洗涤粘附在上部的细胞，然后用4%多聚甲醛固定穿过膜的细胞，最后用0.2%结晶紫染色，显微镜下随机5个视野计数。

1.7 伤口愈合试验 使用EphB6过表达质粒转染细胞，转染24 h后在6孔板中培养成融合的单层。使用10 μL的无菌移液管尖端在单层上画一个线性伤口，用PBS洗涤去除细胞碎片。随后，将细胞在含有10 μM维莫非尼或1 μM达帕非尼的无血清培养基中培养24 h。在0和24 h拍摄损伤单层，计算伤口愈合面积。

1.8 统计学方法 数据用GraphPadPrism7进行分析。两组间的统计学差异采用双重t检验进行评估。*P<0.05为显著。

2 结果

2.1 BRAF突变型黑素瘤中EphB6的鉴定 维莫非尼和达帕非尼的靶向基因从Pubchem数据库中下载，获得304个共同靶基因(图1a、1b)。然后，分析GSE141484和GSE22838芯片中的差异表达基因，利用药物靶向基因和疾病差异表达基因的交叉，基于log2(Fold变化)>1或<-1，及双尾T检验P值<0.05，得到EphB6(图1c、1d)。

1a、1b：Pubchem数据库中维莫非尼和达帕非尼的结构分子式；1c：维莫非尼和达帕非尼靶向基因从Pubchem数据库下载；1d：来自GSE141484和GSE22838芯片的药物靶向基因和疾病差异表达基因的交叉点，获得EphB6

2.2 过表达EphB6可抑制A375和1205Lu细胞的活力和运动性 EphB6在A375和1205Lu细胞中外源性表达如图2a所示。过表达EphB6对A375和1205Lu细胞活力和运动能力的影响，如图(2b～2d)所示。过表达EphB6显著抑制了A375和1205Lu细胞在450 nm处的OD值和克隆形成，说明EphB6抑制了A375和1205Lu细胞的增殖和生长。此外，EphB6的过表达也通过基质凝胶显著阻碍了A375和1205Lu细胞的穿透速度和伤口愈合，如图(2e～2h)所示。结果表明，过表达EphB6可以抑制A375和1205Lu细胞的侵袭和迁移能力。

将pcDNA3.1-EphB6质粒转染到A375和1205Lu细胞中，(2a)检测EphB6、(2b)增殖、(2c、2d)克隆形成、(2e、2g)侵袭和(2g、2h)迁移的蛋白表达。*P<0.05。

2.3 EphB6过表达促进维莫非尼和达帕非尼对A375和1205Lu细胞活力和运动能力的抑制作用 随后，我们检测了EphB6过表达与维莫非尼或达帕非尼的协同作用。与单独使用维莫非尼(或达帕非尼)治疗相比，过表达EphB6和维莫非尼(或达帕非尼)治疗显著降低了450 nm处的OD值(图3a、3b)。通过A375和1205Lu细胞的transwell细胞数以及创面愈合速度(图3c～3f、4a～4d)。这些结果表明，过表达EphB6可能促进维莫非尼和达帕非尼对BRAFV600E突变型黑素瘤细胞恶性增殖和侵袭的抑制作用。

将pcDNA3.1-EphB6质粒转染A375和1205Lu细胞，10 μM维莫非尼或1 μM达帕非尼处理的细胞24 h，检测(a、b)增殖和(c～f)侵袭。*P<0.05

将pcDNA3.1-EphB6质粒转染A375和1205Lu细胞、10 μM维莫非尼或1 μM达帕非尼处理的细胞24 h，通过伤口愈合试验检测细胞迁移。*P<0.05

3 讨论

人类Eph受体是由14个成员组成的最大的受体酪氨酸激酶家族，根据其配体的序列同源性和对其的亲和力，将成员分为A型和B型。人类的ephrin家族由8个已知的成员组成，根据序列同源性和与Eph受体相互作用的类型，它们同样分为A类和B类。EphA类由成员A1-A8和A10成员组成，与5个ephrin分子(A1-A5)混合；而EphB类由EphB1-B4和B6组成，主要与三个ephrinB配体eprinB1-B3结合。ephrins除了作为配体还可以在细胞中传递信号，但是对它们的具体途径的研究很少[9]。

先前的研究表明，黑素瘤转移相关疾病的进展与EphB6基因表达降低之间存在显著的相关[11]。在本研究中，我们首先利用该数据库和芯片鉴定了EphB6的表达与维莫非尼和达帕非尼的肿瘤抑制机制相关，以及黑素瘤细胞中EphB6的表达与黑素瘤细胞中BRAFV600E突变相关。随后，体外细胞实验证实了过表达EphB6对BRAFV600E突变体黑素瘤细胞的增殖和运动有显著的抑制作用。此外，Caleb的研究还揭示了EphB6作为癌细胞转移抑制剂的作用[13]。黑素瘤细胞利用其部分祖胚胎神经嵴迁移过程来促进侵袭[6]。Caleb发现，过表达EphB6迫使转移性黑素瘤细胞偏离了在鸡胚胎移植模型中观察到的典型迁移模式[13]。此外，过表达EphB6的黑素瘤细胞在绒毛膜尿囊膜转移试验中的转移潜能显著降低[13]。

除了低表达外，在黑素瘤中还发现了编码EphB6的基因突变。新西兰是世界上黑素瘤发病率最高的国家。琼斯等人的研究对466例新西兰黑素瘤患者的转移性黑素瘤样本进行测序分析，发现北岛黑素瘤中EphB6G404S突变的发病率为7.8%(26/466，P=0.0002) ，而南岛黑素瘤样本的发病率为0%[15]。另一项研究涵盖了77例日本原发性和转移性黑素瘤样本，其中21例样本(27%)检测到BRAFV600E突变，6例样本(7.79%)检测到EphB6G404S突变。EphB6G404S突变涉及到纤维连接蛋白结合域的丝氨酸取代甘氨酸，然而，结构-功能分析程序预测该突变是良性的[17]。这些结果表明EphB6在黑素瘤的转移进展中发挥了重要作用。

最重要的是，本研究发现了过表达EphB6与维莫非尼和达帕非尼治疗对抑制黑素瘤的协同作用。通过以上结果推测，EphB6类似物与BRAFi的联合作用有利于黑素瘤的临床治疗。

总而言之，过表达EphB6可以显著抑制黑素瘤的转移进展，有利于黑素瘤的BRAFi治疗。