青春期后发病的色素异常性皮肤淀粉样变家系相关基因突变研究

马立文 曾 霓 骆 丹

1南京医科大学鼓楼临床医学院皮肤性病科，江苏南京，210008;2南京医科大学第一附属医院皮肤性病科，江苏南京，210008

原发性局限性皮肤淀粉样变(primary localized cutaneous amyloidosis，PLCA)是一种以皮肤真皮浅层淀粉样物质为特征的慢性瘙痒性皮肤病，本病只涉及皮肤一般不累及内脏系统[1]。临床上一般分为斑疹型、丘疹型和结节型，其他特殊类型包括色素异常性淀粉样变(amyloidosis cutis dyschromica，ACD)、皮肤异色病样淀粉样变、大疱性淀粉样变和肛门、骶部淀粉样变[2]。色素异常性淀粉样变发病率低，以瘙痒为症状的弥漫性的色素沉着伴色素减退斑为特征，一般不伴有皮肤萎缩和毛细血管扩张。大多数的PLCA都是散发病例，家族聚集现象主要被报道在南美洲、东南亚及中国，并且这些家族多表现为常染色体显性遗传[3]。通过遗传连锁分析和候选基因筛查确定本病遗传易感性和两个基因突变相关：OSMR 和IL31RA基因。到目前为止有十余个OSMR基因突变和2个IL31RA突变被报道[4-9]。我们检测了一例位于中国南部的ACD家系。

1 临床资料

本家系两代人中共有5例患者(图1)，表现为常染色体显性遗传。先证者为发育正常的56岁女性，该患者约20年前背部出现斑点状色素沉着和色素减退斑并伴有瘙痒，后其四肢亦出现类似皮损，无苔藓样丘疹，否认光敏现象及水疱史，系统检查未见明显异常。先证者的姐姐、弟弟、外甥及女儿均有类似皮损，均为青春期后发病，因先证者的父母已经去世。故不能求证他们是否也患此病。该家系均为非近亲结婚。

图1 ACD家系图

2 实验方法和仪器

2.1 DNA提取 经该家系成员知情同意并经伦理委员会批准后抽取该家系5例患者的外周血各约5 mL并用EDTA抗凝，以无皮肤病的健康人DNA为对照。采用杭州宝赛生物科技有限公司血液抽提试剂盒抽提基因组DNA。

2.2 PCR扩增 根据Genebank上序列信息(OSMR基因依据NT_006576，IL31RA基因依据NM_139017)使用Primer Premier 5设计基因引物。0SMR基因第12号外显子引物序列：上游5’-TAAGAGACAAGAACTCACCC-3’，下游5’-GAAGTAGTCCAGAAATCCCA-3’，13号外显子引物序列：上游5’-CTCTGCCTCTTGGGTTCA-3’，下游5’-TTGGGTATGGTGCTGACA-3’，14号外显子引物序列：上游5’-AGAGCTGGCTATGGTTCTTC-3’，下游5’-AGCTGGTGGTGTTTCAGATG-3’，15号外显子引物序列：上游5’-GGTGGTGCTGAGTTAACAAG-3’，下游5’-AATTGTCTCAAGGGCCACTG-3’，IL31RA基因第12号外显子引物序列：上游5’-TGGAAGCACAGGTTCCAATG-3’，下游5’-CCAGGAAGGTTGGTGAACAG-3’。采用的PCR反应体系总体积为25 μL。使用ABI 9700PCR扩增仪，PCR反应条件：94℃预变性5 min后进入循环，94℃变性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸1 min，40个循环；最终72℃延伸7 min，最后4℃保存。50 μL PCR产物中加入溴酚蓝加样缓冲液5 μL，混匀后将全部55 μL样品分别加在2个加样孔中，1.5%琼脂糖凝胶 ，100 V电泳100 min，EB染色，紫外线灯下切取胶带。杭州宝赛生物科技有限公司纯化试剂盒纯化。

2.3 Sanger基因测序 PCR产物分离纯化后应用Big Dye Direct Sanger Sequencing Kit在ABI3500基因测序仪进行直接双向测序，此项工作由杭州宝赛生物科技有限公司完成。测序分析结果与Genbank中人类OSMR基因的12～15号外显子及IL31RA基因第12号外显子的标准序列进行比对。

3 结果

3.1 皮肤科及病理检查 患者的背部、上臂及大腿可见弥漫性的色素沉着伴色素减退斑，以背部及上肢为重(图2a、2b)，未见明显红斑、丘疹、水疱、皮肤萎缩及毛细血管扩张，系统检查未见明显异常。取自先证者的上臂组织可见真皮乳头层有团块状嗜酸性物质沉积，结晶紫染色阳性(图2c)，提示为淀粉样物质沉积。根据该患者临床表现和组织病理学检查结果诊断为ACD。

2a、2b:背部及上肢弥漫性色素沉着斑及色素减退斑；2c:真皮乳头状区无定形嗜酸性肿块(HE,×100)；2d:结晶紫染色阳性(HE,×100)

3.2 临床表现 该家系成员中Ⅱ2、Ⅱ3、Ⅱ5、Ⅲ1及Ⅲ2可见上臂、大腿或背部可见弥漫性的色素沉着伴色素减退斑，均未见红斑、丘疹、水疱、皮肤萎缩及毛细血管扩张，Ⅱ2伴有瘙痒，其他人无明显瘙痒，且均无光敏及水泡史。该家系所有患者临床表现均符合ACD，并表现为常染色体显性遗传。

3.3 测序结果 通过基因测序及后续比对并未发现本家系中成员存在OSMR和IL31RA基因突变。通过检查我们发现cSNP，患者Ⅲ2存在SNP:rs2278329, c.1657G→A(图3a)；患者Ⅱ3、Ⅱ4和Ⅲ1存在SNP: rs161704, c.1586G→A(图3b)。

图3 ACD家族中OSMR和IL31RA基因突变分析

4 讨论

ACD是原发性皮肤淀粉样变的一种罕见类型，由日本的Morishma在1970年首次报道 ，ACD具有以下特点：(1)皮损为弥漫分布的色素沉着伴色素减退斑；(2)轻度或不伴痒感；(3)青春期前发病；(4)组织病理见真皮乳头层淀粉样样物质沉积[10,11]。原发性皮肤淀粉样变病中的另一亚型皮肤异色病样淀粉样变(poikilodenna—like cutancous amyloidosis，PCA)与ACD表现相似。Ogino等[12]在1977年将PCA分为两类：一般型和PCA综合征。一般型PCA的主要特征：有皮肤异色病典型皮损，有苔藓样丘疹，多有光敏性，于日晒后皮损加重，不具有水疱和掌跖角化，也不伴有系统受累，组织病理学改变可见真皮乳头内有淀粉样物质沉着，一般成年后发病。PCA综合征的主要特征：具有皮肤异色病样损害，苔藓样丘疹，组织病理检查可见真皮层淀粉样物质沉积，多具有光敏性，可出现水疱或掌跖角化病等，一般身材矮小，发病年龄较早。由此可见两者临床表现有较多重叠，且病理检查不能鉴别，并且亦有国外学者认为ACD是皮肤异色病样淀粉样变的亚型[13]。因此这两种PLCA亚型之间的关系有待进一步研究。本家系患者符合ACD的特点，因此本家系患者诊断为ACD。但是本家系患者均为青春期后发病更为少见，国外有学者曾报道一例青春期后发病的ACD[14]。另外本病需与先天性皮肤异色病、着色性干皮病、血管萎缩性皮肤异色病、皱褶部网状色素沉着症、遗传性泛发性色素异常等具有皮肤异色病样改变的疾病相鉴别，可通过组织病理及结晶紫或刚果红特殊染色进行明确。

既往研究通过定位候选克隆的方法发现OSMR基因和IL31RA基因和PLCA发病相关，这两种基因都属于IL-6受体基因家族。OSMR基因编码抑瘤素M受体β(oncostatin M receptor-beta，OSMRβ)，OSMRβ是OSM II型受体和IL31受体两种细胞因子的组成成分[8,9]。OSM II型受体包括OSMRβ和gp130[15]，IL31RA基因编码IL31受体α，后者与OSMRβ结合组成IL-31受体。既往报道的突变都位于OSMRβ和IL-31RA的FNIII结构域，FNIII结构域在受体的二聚化及后续的信号传导过程中起着关键作用，所以本区域的突变导致Jak/STAT、MAPK及 PI3K/Akt信号通路中OSM或IL-31配体与受体结合后信号不能正常传导[4]。体外研究中通过去除或替换FNIII结构域中的一个氨基酸证实了这个家族受体在受体二聚化中的关键作用[16]。中国学者进一步证实了OSMR突变导致OSM/OSMRβ/STAT5/KLF7轴的失调可能导致PLCA[17]。Arita等发现用OSM及IL-31刺激体外培养伴有OSMR突变的PLCA家族的角质形成细胞，经过OSM刺激后Jak/STAT、MAPK及PI3K/Akt 信号通路的活性减弱程度为65%～90%，IL-31刺激后活性减弱100%。现在研究认为OSM在炎症刺激中维持痛觉并利于发现外来的有害刺激[18]。敲除OSM后的小鼠对于急性热、化学、机械及内脏痛等各种刺激的反应减弱或消失[19]。OSM还可以促使角质形成细胞迁移及表皮增殖[20]，推测可能和PLCA的角化过度及棘层肥厚有关。IL-31在皮肤瘙痒中起着重要作用[21]，Dillon[22]发现小鼠的淋巴细胞过表达IL-31会诱发瘙痒及皮肤病，结节型痒疹中有着较高水平的IL-31表达[23]，IL-31可以激活STAT3信号通路并通过IL-31RA调节可能和细胞凋亡相关的细胞周期蛋白[24]。因此IL31RA基因突变可能和PLCA中的瘙痒产生有关。由此可推测OSMR基因和IL31RA基因的突变可能通过影响皮肤相应的信号通路而导致PLCA的发生。

目前在OSMR基因中发现的十余种PLCA致病突变，在IL31RA基因中发现了2种PLCA致病突变。其中p.Pro694Leu和p.Gly513Asp为高频突变位点，并且有家族史的PLCA患者中OSMR基因突变率明显高于无家族史患者[25]这些突变集中在OSMR基因的12-15号外显子及IL31RA基因的12号外显子，所以我们检测了本家系中的这些外显子，但是并没有检测到突变基因，可能和样本量少或存在其他基因突变位点有关，需要进一步验证。不过亦有国内学者林杨杨[26]及国外学者Sakuma[24]也曾有ACD家系中没有发现基因突变的报道。另外有学者[27]在ACD患者中发现存在GPNMB基因突变，与黑素小体形成、自噬、吞噬、组织修复和炎症负性调节有关的GPNMB的缺失可能和ACD的发病有关，近期冯婉婷等[28]亦发现GPNMB基因在ACD患者中存在突变，为ACD致病基因的研究提供了新的方向，但是其具体致病机制尚不清楚[29]。另外，在本家系中的OSMR基因的12～15号外显子及IL31RA基因的12号外显子中检测到两处SNP，这两处SNP也分别在两个国内家系中被检测出[6,30]。但是其在PLCA的发病中是否发挥作用尚不清楚。

总之，PLCA的病因存在遗传异质性，OSMR、IL31RA和GPNMB基因在PLCA的发病中发挥重要作用，OSMR基因突变可能和PLCA的角化过度及棘层肥厚有关，IL31RA基因突变可能和PLCA瘙痒有关，GPNMB基因可能和色素异常有关。另外ACD是否有特定的基因突变位点以及SNP在PLCA的发病中是否起作用也有待进一步研究。