七氟醚通过HIF信号通路对糖尿病心肌保护作用的研究

李瑾 古力帕日·克力木 马宁

糖尿病可引起心肌功能障碍，据不完全统计，我国心脑血管疾病高发人群中约有11.6%患有糖尿病，糖尿病性心肌病及其与心脏相关并发症的发病率、死亡率逐年上升［1-2］。心血管疾病史、糖尿病史、麻醉等均与围手术期患者心肌缺血再灌注（ischemia reperfusion，I/R）损伤有关［3-4］。因而如何避免糖尿病患者I/R 损伤成为亟待解决问题。七氟醚可减轻心肌I/R 损伤，已有研究表明七氟醚后处理（sevoflurane postconditioning，SPostC）也具有保护心肌组织的作用［5］。HIF 信号通路关键蛋白为缺氧诱导因子-1α（Hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α），该信号通路失活可能减弱SPostC 对糖尿病大鼠心肌I/R 损伤的保护作用［6］。因此，本研究通过建立糖尿病大鼠心肌I/R 损伤模型，探讨SPostC 是否可通过调控HIF 信号通路而对糖尿病心肌组织发挥保护作用。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

110 只健康雄性SD 大鼠购自北京斯贝福生物技术有限公司，动物许可证号：SCXK（京）2019-0010，210～260 g，自由饮食、进水，常规培养7 d。

活性氧（Reactive oxygen species，ROS）检测试剂盒购自上海碧云天；丙二醛（Malondialdehyde，MDA）检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所；七氟醚购自美国Abbott Laboratories；HIF 信号通路激活剂去铁胺（Deferoxamine，DFO）购自美国默克公司；白细胞介素-1β（Interleukin-1β，IL-1β）、白细胞介素-6（Interleukin-6，IL-6）、肿瘤坏死因子-α（Tumor necrosis factor-α，TNF-α）检测试剂盒、兔抗鼠缺氧诱导因子-1α（Hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α）、促红细胞生成素产生肝细胞配体A1（Erythropoietin producing hepatocellular receptor A1，EphrinA1）抗体、内参甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗体、辣根过氧化物（horseradish peroxidase，HRP）标记的山羊抗兔活性免疫球蛋白（Active immunoglobulin，IgG）二抗购自美国Abcam。

1.2 方法

1.2.1 建立模型［7］

大鼠禁食12 h，注射浓度为50 mg/kg 的链脲佐菌素，72 h 取尾部静脉血，检测血糖浓度高于16.7 mmol/L，采用高脂高糖食物持续喂养8 w，若大鼠出现多饮、多食、重量减轻视为成功建立糖尿病模型。取糖尿病大鼠模型建立I/R 损伤模型：麻醉大鼠（25%乌拉坦），固定大鼠四肢，监测大鼠心电图，暴露颈部前切口，插管，连接呼吸机通气，在左侧四五肋间（胸骨）开胸，剪开暴露心脏的心包膜，用丝线（6-0）从左心耳下方3 mm 穿透左冠脉前降支，小管阻塞冠脉引起缺血30 min，松开结扎线，ST 段（ST segment）降低，缺血区域发红，视为造模成功（80 只）。穿线但不结扎作为假手术组（sham组）（30只）。

1.2.2 实验分组

取I/R 建模成功大鼠，随机分为I/R 组、I/R+SPostC 组（I/R 损伤大鼠再灌注2.4%七氟醚的K-H溶液15 min、正常K-H 溶液105 min）［8］、I/R+DFO组（心肌缺血处理前24 h 腹腔注射DFO）［9］、I/R+SPostC+DFO 组（心肌缺血处理前24 h 腹腔注射DFO，其余步骤同I/R+SPostC 组），每组各20 只。

1.2.3 检测大鼠血流动力学指标

Powerlab/8SP 采集系统记录各组大鼠左室发展压（left ventricular developed pressure，LVDP）、左室舒张末期压（Left ventricular end diastolic pressure，LVEDP）、左室内压最大上升速率（Maximum rise rate of left ventricular pressure，+dp/dtmax）。

1.2.4 检测ROS、MDA 水平

取各组大鼠心肌组织分为两部分，一部分用于检测ROS、MDA 水平，另一部分用于检测HIF-1α、EphrinA1 蛋白表达量。采用DHE 荧光探针法检测ROS 水平，硫代巴比妥酸法检测MDA 水平，严格按照试剂盒说明书操作。

1.2.5 ELISA 法检测IL-1β、IL-6、TNF-α 水平

从各组大鼠颈总动脉分别抽取3 mL 血液样本，放入含有肝素抗凝试管中，4℃条件下放置1 h，3 000 r/min 离心10 min（半径10 cm），吸取上清液，采用酶联免疫吸附测定（Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）法检测IL-1β、IL-6、TNF-α水平，应用ANTHOSHT11 型酶标仪（上海赛默生物科技发展有限公司）进行检测。

1.2.6 Westernblot检测HIF-1α、EphrinA1蛋白表达量

各组大鼠心肌组织中分别加入400 μL RIPA裂解液提取总蛋白，取40 μg 蛋白样品，十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）后转膜，37℃封闭2 h，分别加入HIF-1α（1∶1 000）、EphrinA1（1∶1 000）、GAPDH（1∶2 000）抗体稀释液，4℃孵育24 h，洗膜，加入二抗（1∶3 000）稀释液，37℃孵育1 h，ECL 显影，ImageJ 软件分析蛋白条带灰度值。

1.3 统计学分析

采用SPSS 21.0 统计学软件分析数据，计量资料以（±s）表示，两组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠血流动力学指标检测

与sham 组比较，I/R 组LVDP、+dp/dtmax 水平降低，LVEDP 水平升高，差异均有统计学意义（P＜0.05）；与I/R 组比较，I/R+DFO 组、I/R+SPostC+DFO 组LVDP、+dp/dtmax 水平升高，LVEDP 水平降低差异均有统计学意义（P＜0.05）；与I/R+DFO组比较，I/R+SPostC+DFO 组LVDP、+dp/dtmax 水平升高，LVEDP 水平降低，差异均有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

表1 各组大鼠血流动力学指标检测（±s）Table 1 Detection of hemodynamic indexes of rats in each group（±s）

表1 各组大鼠血流动力学指标检测（±s）Table 1 Detection of hemodynamic indexes of rats in each group（±s）

注：与sham 组相比，aP＜0.05；与I/R 组相比，bP＜0.05；与I/R+DFO 组相比，cP＜0.05。

分组sham I/R I/R+SPostC I/R+DFO I/R+SPostC+DFO F 值P 值n 30 20 20 20 20 LVDP/mmHg 78.52±6.57 44.31±4.25a 45.33±3.24a 57.82±3.59ab 63.42±4.48abc 215.149＜0.05 LVEDP/mmHg 6.11±0.69 18.15±1.32a 17.85±1.02a 13.23±0.85ab 8.78±0.54abc 828.984＜0.05+dp/dtmax/mmHg·s-1 2803.51±162.32 1492.65±172.33a 1536.82±157.22a 2263.85±180.41ab 2459.71±135.41abc 295.156＜0.05

2.2 各组大鼠ROS 水平、MDA 含量比较

与sham 组比较，I/R 组ROS、MDA 水平升高，差异有统计学意义（P＜0.05）；与I/R 组比较，I/R+DFO 组、I/R+SPostC+DFO 组ROS、MDA 水平降低，I/R+SPostC+DFO 组低于I/R+DFO 组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

表2 各组大鼠ROS 水平、MDA 含量比较（±s）Table 2 Comparison of ROS level and MDA content in each group of rats（±s）

表2 各组大鼠ROS 水平、MDA 含量比较（±s）Table 2 Comparison of ROS level and MDA content in each group of rats（±s）

注：与sham 组相比，aP＜0.05；与I/R 组相比，bP＜0.05；与I/R+DFO 组相比，cP＜0.05。

分组sham I/R I/R+SPostC I/R+DFO I/R+SPostC+DFO F 值P 值n 30 20 20 20 20 ROS 水平（%）75.23±6.57 154.33±12.36a 151.57±10.49a 113.41±8.75ab 88.54±6.78abc 363.381＜0.05 MDA（nmol/mL）1.85±0.26 8.52±0.62a 8.27±0.71a 6.12±0.44ab 4.57±0.29abc 827.750＜0.05

2.3 各组大鼠血浆中炎症因子的比较

与sham 组比较，I/R 组IL-1β、IL-6、TNF-α 水平升高，差异有统计学意义（P＜0.05）；与I/R 组比较，I/R+DFO 组、I/R+SPostC+DFO 组IL-1β、IL-6、TNF-α 水平降低，I/R+SPostC+DFO 组低于I/R+DFO 组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。见表3。

表3 各组大鼠血浆中炎症因子的比较（±s）Table 3 Comparison of inflammatory factors in plasma of rats in each group（±s）

表3 各组大鼠血浆中炎症因子的比较（±s）Table 3 Comparison of inflammatory factors in plasma of rats in each group（±s）

注：与sham 组相比，aP＜0.05；与I/R 组相比，bP＜0.05；与I/R+DFO组相比，cP＜0.05。

TNF-α（pg/mL）193.58±25.52 579.75±56.18a 582.63±47.12a 299.74±24.41ab 253.36±21.03abc 575.407＜0.05分组sham I/R I/R+SPostC I/R+DFO I/R+SPostC+DFO F 值P 值n 30 20 20 20 20 IL-1β（pg/mL）151.48±19.30 474.74±39.39a 459.11±38.63a 234.38±23.75ab 171.26±20.90abc 650.207＜0.05 IL-6（pg/mL）119.17±13.32 554.86±52.70a 538.64±45.62a 239.12±27.10ab 162.64±19.71abc 854.828＜0.05

2.4 各组大鼠HIF-1α、EphrinA1 蛋白表达的比较

与sham 组比较，I/R 组HIF-1α、EphrinA1 蛋白水平降低，差异有统计学意义（P＜0.05）；与I/R 组比较，I/R+DFO 组、I/R+SPostC+DFO 组HIF-1α、EphrinA1 蛋白水平升高，I/R+SPostC+DFO 组高于I/R+DFO 组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。见图1、表4。

表4 各组大鼠HIF-1α、EphrinA1 蛋白表达的比较（±s）Table 4 Comparison of HIF-1α and EphrinA1 protein expressions in each group of rats（±s）

表4 各组大鼠HIF-1α、EphrinA1 蛋白表达的比较（±s）Table 4 Comparison of HIF-1α and EphrinA1 protein expressions in each group of rats（±s）

注：与sham 组相比，aP＜0.05；与I/R 组相比，bP＜0.05；与I/R+DFO组相比，cP＜0.05。

分组sham I/R I/R+SPostC I/R+DFO I/R+SPostC+DFO F 值P 值n 30 20 20 20 20 HIF-1α 0.83±0.04 0.32±0.05a 0.34±0.06a 0.50±0.05ab 0.71±0.05abc 492.205＜0.05 EphrinA1 0.78±0.07 0.25±0.04a 0.26±0.05a 0.49±0.06ab 0.65±0.05abc 405.447＜0.05

图1 各组大鼠HIF-1α、EphrinA1 蛋白表达的比较Figure 1 Comparison of HIF-1α and EphrinA1 protein expressions in each group of rats

3 讨论

针对心血管疾病主要是恢复心肌组织血流再灌注，缺血预处理可减轻心肌I/R 损伤，但操作过程中无法准确预测缺血发生时间点等问题，已有研究表明SPostC 具有保护心肌组织的作用，且具有安全性、可控性等优点，并可减轻大鼠心肌I/R损伤，但在糖尿病条件下SPostC 的保护作用被弱化［10-11］。本研究结果显示，SPostC 处理后大鼠血流动力学相关指标较I/R 组无显著差异，提示SPostC对糖尿病心肌I/R 损伤的作用被减弱及其对心肌功能的作用明显降低。EphrinA1 属于HIF-1α 下游调节因子，可减小大鼠心肌梗死面积、减轻心肌组织损伤，心肌组织（细胞）缺氧时HIF-1α 被激活，HIF-1α 进入缺氧反应原件核心后激活EphrinA1，EphrinA1 可调节α-微管蛋白磷酸化而维持心肌细胞结构、功能从而抑制炎症、细胞凋亡［12-13］。

DFO 是HIF 信号通路激活剂，原理上是通过抑制脯氨酰羟化酶而激活HIF-1α 等转录因子，本研究结果显示，糖尿病心肌I/R 损伤大鼠LVDP、+dp/dtmax 水平降低，LVEDP 水平升高，而DFO 处理后LVDP、+dp/dtmax 水平升高，LVEDP水平降低，且SPostC+DFO 联合作用明显优于DFO单独作用，提示SPostC+DFO 联合作用可改善糖尿病心肌I/R 损伤大鼠的血流动力学增强SPostC 对心肌组织的保护作用。线粒体内ROS 生成量过多可激活NLRP3 炎性小体，该小体活化可促使蛋白水解，caspase-1 被激活可促进炎性细胞因子表达，加重心肌组织炎症损伤［14］。机体内氧化、抗氧化酶类失衡导致氧自由基大量生成，过度氧化可损害组织功能，MDA 属于脂质过氧化物酶类，其水平升高表示氧化应激能力增强，降低其表达可减轻心肌细胞损伤［15］。本研究结果显示，糖尿病心肌I/R 损伤大鼠心肌组织中ROS、MDA 水平升高，DFO、SPostC+DFO 作用后可降低ROS、MDA 水平，且SPostC+DFO 作用改善程度大于DFO 单独作用，提示SPostC+DFO 作用可通过抑制氧化应激反应而减轻糖尿病心肌I/R 损伤。持续高血糖水平导致机体代谢紊乱，炎性反应、氧化应激均被激活导致心肌细胞功能改变，炎症反应与心肌I/R损伤有关，麻醉药物对缺血心肌组织具有保护作用，其可抑制炎性反应、减小心肌梗死面积并可改善心功能，TNF-α 可促进相关炎性因子合成、释放，还可促进氧自由基生成进而加重心肌I/R 损伤，IL-1β、IL-6 可加重心肌组织炎症反应进而引起损伤［16］。本研究结果显示，糖尿病心肌I/R 损伤大鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α 水平升高，DFO、SPostC+DFO 作用后可降低IL-1β、IL-6、TNF-α 水平，SPostC+DFO 降低炎性因子表达水平的程度明显优于DFO 单独作用，提示SPostC+DFO 可通过抑制炎症反应而减轻糖尿病心肌I/R 损伤。表明DFO具有抗炎、抗氧化作用，并可恢复SPostC 对糖尿病心肌I/R 损伤的保护作用。本研究进一步分析发现，糖尿病心肌I/R 损伤大鼠心肌组织中HIF-1α、EphrinA1 蛋白水平降低，DFO、SPostC+DFO 均可促进HIF-1α、EphrinA1 蛋白表达，SPostC+DFO 对HIF-1α、EphrinA1 蛋白表达的调控作用明显强于DFO 单独作用，提示DFO 可通过激活HIF 信号通路而减轻心肌组织损伤，SPostC+DFO 可能通过促进HIF-1α、EphrinA1 表达而抑制炎症、氧化应激反应从而强化SPostC 对糖尿病心肌I/R 损伤的保护作用。综上所述，SPostC、DFO 联合处理可激活HIF信号通路而改善血流动力学、抑制炎症反应及氧化应激反应从而增强七氟醚对糖尿病心肌的保护作用。