黄芩苷对糖尿病大鼠心肌保护机制研究

徐秋玲 郑学芝 王文婷 张绪东 郭 冉

牡丹江医学院生理教研室，黑龙江牡丹江 157011

糖尿病是一种慢性内分泌和代谢紊乱疾病，糖尿病心肌病是糖尿病的并发症之一[1]。线粒体功能障碍、自噬和炎症参与心脏肥大和心肌纤维化的病理机制，增加心力衰竭的风险[2]。 线粒体呼吸链复合物功能异常参与糖尿病鼠脑组织损伤的病理过程[3]，线粒体呼吸链复合物是否参与糖尿病心肌损伤的病理过程报道较少。 黄芩苷（C21H18O11）是中药黄芩的主要活性成分，具有抗炎、抗氧化、镇静、调节免疫等作用[4-6]。 黄芩苷能改善链脲佐菌素（streptozotocin，STZ）诱导的糖尿病鼠的氧化应激状态[7]。 本课题组前期研究发现黄芩苷对糖尿病鼠心肌有保护作用，但黄芩苷对心肌的保护作用是否与心肌线粒体有相关性报道较少。本研究探讨黄芩苷对糖尿病鼠心肌线粒体呼吸链复合物的保护作用。

1 对象与方法

1.1 实验动物

24 只健康雄性SD 鼠购于北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号：SCXK（京）2016-0006，饲养于SPF/VAF 级动物室，室温18～25℃，相对湿度50%～80%，每日光照12 h，自由摄食、饮水。 适应性饲养1周后进行实验。动物实验经牡丹江医学院动物实验伦理委员会审核批准。

1.2 主要仪器与和试剂

血糖仪（美国强生公司，20202221732），荧光定量PCR 仪（美国Invirtogen 公司，A43162），黄芩苷（Sigma公司，MFCD00134418），生理盐水配制药液，STZ（美国Sigma 公司，MFCD00006607）， 线粒体呼吸链复合物试剂盒（南京建成生物工程研究所，A089-1、A089-2、A089-3、A089-4）， 实时荧光定量聚合酶链式反应法（quantitative real-time PCR，qPCR）试剂盒（美国Invirtogen 公司，F455XL），一抗兔抗鼠ND1（M02292）、β-actin 多克隆抗体（BM3873）和羊抗兔IgG（博士德生物工程有限公司，BA1039）。

1.3 实验分组及处理

取24 只雄性SD 鼠随机分为对照组（6 只）、黄芩苷对照组（6 只）、模型组（6 只）、治疗组（6 只）。 其中对照组用正常普通饲料饲养， 同时腹腔注射与黄芩苷等容积的生理盐水；黄芩苷对照组用正常普通饲料饲养，同时腹腔注射黄芩苷药液15 μmol/（L·kg·d）。模型组和治疗组尾静脉注射STZ 45 mg/kg（溶于0.1 mmol/L 枸橼酸缓冲液），72 h 后连续2 次空腹血糖≥16.7 mmol/L 为糖尿病模型。 模型组用正常普通饲料饲养， 同时腹腔注射与黄芩苷等容积的生理盐水；治疗组用正常普通饲料饲养，同时腹腔注射黄芩苷药液15 μmol/（L·kg·d）。 连续用药8 周后，动物禁食12 h，用10%水合氯醛（3.5 ml/kg）腹腔麻醉，然后在冰上快速取心脏组织，称重记录，放入液氮10 s，然后置于-80℃冰箱中冷冻储存备用。

1.4 观察指标及评价标准

1.4.1 各组鼠血糖值比较 断尾收集血样，采用血糖监测仪（试纸）法测定血糖。

1.4.2 电镜观察心肌线粒体 将心肌组织切成小块（＜1 mm3）， 迅速置于4°C 的4%戊二醛中进行固定，连续酒精脱水（50%、75%、95%和100%）后，包埋样品，进行超薄切片，用乙酸铀酰和柠檬酸铅染色超薄切片[8]，透射电子显微镜观察心肌组织，计算损伤线粒体比例。

1.4.3 制备心肌组织线粒体溶液和测定呼吸链复合物活性 冰浴中将心肌剪成碎块，加入匀浆缓冲液匀浆30 s，间隔30 s，重复3 次。 800 g 离心10 min；取上清800 g 离心10 min； 取上清12 000 g 离心15 min，弃上清，所得沉淀12 000 g 离心15 min，沉淀物为线粒体。参照试剂盒说明测定线粒体呼吸链复合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ活性，将待测样品放于冰槽，准备背景对照，读数0～3 min，分别检测样品总活性和非特异性活性，样本特异活性=样本总活性-样本非特异活性。

1.4.4 qPCR 检测线粒体呼吸链复合物I 蛋白亚基ND1m RNA 提取鼠心肌线粒体，检测RNA 纯度，样品选取标准为A260/A230＞2.0 且1.8＜A260/A280＜2.1，根据qPCR 引物合成要求，使用Primer 3 软件进行引物设计， 上海生工生物有限公司合成目的基因和内参。 ND1 引物长度为331 bp，FP：5′-CGGCTCCTTCTCCCTACAA-3′；RP：5′-TCGACGTTAAAGCCTGAGACT-3′。 内参引物porin 长度为211 bp，FP：5′-GTTGGCTATAAGACGGATGA-3′；RP：5′-CCTGATACTTGGCTGCTATT-3′。qPCR 反应体系：SYBR Green 9 μl，cDNA 2 μl，正向引物2 μl，反向引物2 μl。 逆转录条件：37°C 水浴15 min，50°C 水浴5 min，90°C 水浴5 min，离心，置于冰上。qPCR 条件：95℃20 s，65℃35 s，72℃40 s，共40 个循环。 溶解曲线条件为：95℃15 s，60℃30 s，95℃15 s。 用2-△△CT法计算目的基因相对于内参基因相对表达量[9]。

1.4.5 Western blot 检测线粒体呼吸链复合物I 蛋白亚基ND1 心肌组织200 mg 加1 ml 裂解缓冲液，冰上研磨匀浆，4℃15 000 g 离心15 min， 取上清液，蛋白定量，进行分装，每管蛋白为50 μg，冻存于-80℃冰箱备用。 Western blot 步骤：电泳，转膜，分别加入抗ND1、β-actin 一抗抗体孵育（封闭液稀释一抗l∶500），4℃过夜，TBST 洗2 次，每次5 min，加入二抗（封闭液稀释二抗l∶2000），室温10 min，TBST 洗3 次，每次5 min。滤膜于显色液中反应1 min。 置于凝胶图像成像分析系统，曝光各组蛋白条带，拍照并计算灰度值。

1.5 统计学方法

采用SPSS 22.0 统计学软件进行数据分析， 计量资料用均数±标准差（±s）表示，两组间比较采用t 检验；计数资料用率表示，两组间比较采用Fisher 确切概率法，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 四组血糖值的比较

模型组的血糖高于对照组， 差异有统计学意义（P＜0.05）；治疗组的血糖低于模型组，差异有统计学意义（P＜0.05）；对照组和治疗组、黄芩苷对照组的血糖比较，差异无统计学意义（P＞0.05）（表1）。

表1 四组血糖值的比较（mmol/L，±s）

表1 四组血糖值的比较（mmol/L，±s）

注 与对照组比较，aP＜0.05；与模型组比较，bP＜0.05

组别 例数 血糖对照组模型组治疗组黄芩苷对照组6666 4.98±0.03 24.6±1.01a 11.5±2.25b 5.01±0.01

2.2 四组心肌电镜结果及损伤线粒体百分比的比较

电镜观察对照组鼠心肌线粒体形态规则，呈椭圆形，线粒体外膜光滑完整，嵴形态完整；模型组心肌线粒体线粒体空泡样变，嵴断裂或消失，外膜肿胀破裂；治疗组鼠心肌线粒体外膜完整，肿胀减轻，没有嵴断裂；黄芩苷对照组心肌线粒体形态规则，呈椭圆形，线粒体外膜光滑完整，嵴形态完整（图1）。模型组的损伤线粒体百分比高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）；治疗组的损伤线粒体百分比低于模型组，差异有统计学意义（P＜0.05）；对照组和治疗组、黄芩苷对照组的损伤线粒体百分比比较，差异无统计学意义（P＞0.05）（表2）。

图1 各组心肌线粒体电镜下图像（×23 000）

表2 四组损伤线粒体百分比的比较（%，±s）

表2 四组损伤线粒体百分比的比较（%，±s）

注 与对照组比较，aP＜0.05；与模型组比较，bP＜0.05

组别 例数 损伤线粒体百分比对照组模型组治疗组黄芩苷对照组6666 18.4±0.04 70.1±1.06a 34.6±2.32b 18.6±0.01

2.3 四组心肌线粒体呼吸链复合物活性的比较

模型组的心肌线粒体复合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ活性均低于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）；治疗组的心肌线粒体复合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ活性均高于模型组，差异有统计学意义（P＜0.05）；对照组和治疗组、黄芩苷对照组的线粒体酶复合物活性比较，差异无统计学意义（P＞0.05）（表3）。

表3 四组心肌线粒体呼吸链复合物活性的比较[μmol/（min·mg），n=6，±s]

表3 四组心肌线粒体呼吸链复合物活性的比较[μmol/（min·mg），n=6，±s]

注 与对照组比较，aP＜0.05；与模型组比较，bP＜0.05

组别 心肌线粒体复合物Ⅰ心肌线粒体复合物Ⅱ心肌线粒体复合物Ⅲ心肌线粒体复合物Ⅳ对照组模型组治疗组黄芩苷对照组0.115±0.009 0.047±0.010a 0.087±0.002b 0.112±0.001 0.134±0.007 0.082±0.010a 0.101±0.003b 0.133±0.002 0.126±0.011 0.064±0.010a 0.096±0.011b 0.124±0.002 0.128±0.004 0.071±0.010a 0.104±0.009b 0.126±0.003

2.4 四组心肌线粒体呼吸链复合物Ⅰ蛋白亚基ND1 mRNA 的比较

模型组的心肌线粒体复合物Ⅰ蛋白亚基ND1 mRNA 表达低于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）；治疗组的心肌线粒体复合物Ⅰ蛋白亚基ND1 mRNA 表达高于模型组，差异有统计学意义（P＜0.05）；对照组和治疗组、黄芩苷对照组的心肌线粒体复合物Ⅰ蛋白亚基ND1 m RNA 比较，差异无统计学意义（P＞0.05）（表4）。

表4 四组心肌线粒体呼吸链复合物Ⅰ蛋白亚基ND1 mRNA 的比较（±s）

表4 四组心肌线粒体呼吸链复合物Ⅰ蛋白亚基ND1 mRNA 的比较（±s）

注 与对照组比较，aP＜0.05；与模型组比较，bP＜0.05

组别 例数 ND1 mRNA对照组模型组治疗组黄芩苷对照组6666 1.15±0.02 0.47±0.01a 0.92±0.03b 1.13±0.06

2.5 四组心肌线粒体呼吸链复合物Ⅰ蛋白亚基ND1表达的比较

模型组的心肌线粒体复合物Ⅰ蛋白亚基ND1 表达低于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）；治疗组的心肌线粒体复合物Ⅰ蛋白亚基ND1 表达高于模型组，差异有统计学意义（P＜0.05）；对照组和治疗组、黄芩苷对照组的线粒体复合物Ⅰ蛋白亚基ND1 表达比较，差异无统计学意义（P＞0.05），蛋白表达水平：相对光密度ND1/β-actin，灰度值×面积（图2、表5）。

图2 四组心肌线粒体呼吸链复合物Ⅰ蛋白亚基ND1 表达

表5 四组心肌线粒体呼吸链复合物Ⅰ蛋白亚基ND1 表达的比较（±s）

表5 四组心肌线粒体呼吸链复合物Ⅰ蛋白亚基ND1 表达的比较（±s）

注 与对照组比较，aP＜0.05；与模型组比较，bP＜0.05

组别 例数 心肌线粒体呼吸链复合物Ⅰ蛋白亚基ND1对照组模型组治疗组黄芩苷对照组6666 0.78±0.01 0.32±0.03a 0.61±0.04b 0.77±0.01

3 讨论

本研究依据1 型糖尿病动物模型造模方法，应用STZ 72 h 后模型组血糖高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05），模型组空腹血糖均≥16.7 mmol/L，符合糖尿病模型[10]。 糖尿病心肌组织在高糖和高营养应激下， 氧化磷酸化和线粒体三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）生成均降低，影响心肌的功能[11]。研究发现高血糖降低心肌葡萄糖摄取和氧化，线粒体功能障碍导致糖尿病心力衰竭[12]。 本实验电镜结果显示模型组鼠心肌线粒体空泡样变，线粒体嵴断裂或嵴消失，外膜破裂，说明高糖刺激破坏线粒体的结构，推测高糖刺激破坏心肌线粒体结构参与糖尿病心肌病病理过程。

完整的线粒体呼吸链复合物能够同步将电子传递给氧分子，将氧还原成水，在电子传递过程中，产生ATP，供细胞生命活动[13]。呼吸链功能异常影响机体细胞的能量供给。在STZ 诱导的糖尿病大鼠模型肾皮质中发现电子传递链损伤，复合体1 和复合体2 活性下降[14]。 本实验模型组鼠心肌呼吸链复合物活性低于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05），提示高糖不但损伤肾呼吸链也损伤心肌的呼吸链， 导致ATP 合成减少，心肌细胞的能量供给不足，影响心肌细胞功能。

线粒体呼吸链复合物Ⅰ是呼吸链复合物中最为重要的一个，线粒体呼吸链复合物Ⅰ催化三羧酸循环中产生的NADH 所带电子沿呼吸链进行传递。 心肌对能量供给依赖性非常强，对能量缺乏很敏感，因此心肌线粒体复合物Ⅰ的缺陷影响ATP 的合成， 导致能量的供给障碍，干扰心肌细胞功能[15]。 抑制线粒体呼吸链复合物Ⅰ会引起电子从呼吸链中泄露而导致超氧自由基、过氧化氢产生增多，造成心肌细胞膜脂质、蛋白质以及DNA 的氧化损伤，最终导致细胞死亡[16]。 线粒体呼吸链复合物Ⅰ由45 个亚基组成，线粒体基因（mitochondrial DNA，mtDNA）编码其中7 个亚基包括ND1～ND6、ND4L，其余由核DNA 编码[17]。本研究结果显示，模型组的ND1 mRNA 和ND1 蛋白低于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05），提示高糖干扰线粒体呼吸链复合物Ⅰ亚基ND1 的表达， 这进一步说明高糖刺激不但影响线粒体的结构，而且直接抑制线粒体呼吸链复合物Ⅰ亚基ND1 的表达， 降低对心肌细胞的能量供给，降低心肌收缩力，降低心脏做功，影响心肌功能。

黄芩苷是黄芩中主要的黄酮类成分[18]，具有抗氧化、抗炎、调节免疫等功能。 黄芩苷在保护心脏骤停、心肌缺血再灌注损伤和保护心肌细胞等方面均有研究报道[19-21]。 本实验黄芩苷干预后糖尿病鼠的血糖降低，电镜下鼠心肌线粒体外膜完整，肿胀减轻，嵴完整， 推测黄芩苷降低血糖对心肌线粒体具有保护作用。黄芩苷可以提高心肌线粒体呼吸链复合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、 Ⅳ的活性， 增强心肌线粒体复合物Ⅰ亚基ND1 mRNA 和ND1 蛋白表达， 推测黄芩苷可能通过调节线粒体呼吸链复合物活性， 提高复合物Ⅰ亚基ND1 mRNA 和ND1 蛋白表达，增强线粒体合成ATP 能力，增强心肌抗应激耐力，进而对糖尿病鼠心肌细胞起保护作用，但黄芩苷调控线粒体呼吸链复合物的机制尚需进一步研究。

综上所述，黄芩苷可能通过提高线粒体呼吸链复合物活性，增强ND1 mRNA 和ND1 蛋白表达保护糖尿病鼠心肌。