2016—2019年山东省仔猪腹泻病原调查及PEDV分离株S基因遗传进化分析

曹龙龙，孟凡亮，焦秋林， 李 焱， 姜子昕，刘蒙达， 刘思当*

(1.山东农业大学 动物科技学院，山东 泰安 271018;2.中国动物卫生与流行病学中心，山东 青岛 266032)

腹泻是仔猪最常见的一类疾病，其中以猪流行性腹泻(porcine epidemic diarrhea，PED)最为重要。PED是由猪流行性腹泻病毒(PEDV)引起的一种猪高度接触性肠道传染病，临床上以呕吐、水样腹泻、消瘦以及脱水为基本特征[1-2]，并有较高的病死率。PEDV为冠状病毒科、甲型冠状病毒属成员，属线性单股正链RNA病毒，其参考毒株为CV777[3]。该病毒全基因组长28 kb，包含编码复制酶(Rep)、纤突糖蛋白(S)、基质蛋白(M)、囊膜蛋白(E)、核蛋白(N)和ORF3等6个基因，按照5-Rep-S-ORF3-E-N-3顺序排列[4]。其中核酸高突变区主要是位于S基因，其由1 387个氨基酸组成。S基因表面抗原决定簇决定病毒毒力，且能与细胞的特异性受体结合，促进细胞膜的融合，产生中和免疫反应[5]。因此，S基因不仅在疫苗研发生产上具有重要意义，而且也是病毒变异分析的主要基因[6]。

自1971年首次在英国暴发PED后，该病很快蔓延至整个欧洲，随后向其他地区扩散[7]。20世纪80年代初中国就陆续有PEDV感染的报道，自2010年秋末开始该病毒的致病性显著增强，在中国呈全国性大流行[8-10]。由PEDV造成的病毒性腹泻发病率明显高于欧洲和其他地区，研究证实流行毒株发生了变异且毒力显著增强(vPEDV)。目前vPEDV在中国仍广为流行，PED仍是威胁中国养猪业的重要疫病之一，给中国养猪业带来了严重的经济损失[11-12]。为了解山东省近年来仔猪腹泻相关病毒的感染状况及发病规律，对2016-2019年间山东省部分地区仔猪腹泻临床病例进行了调查分析，剖检并采集了231份腹泻仔猪的肠道与粪便样品，进行了腹泻相关病毒感染检测以及PEDV的S基因序列分析，为vPEDV的疫苗研发及腹泻病综合防控提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 主要试验材料Viral RNA/DNA提取试剂盒和pMD18-T载体购自TaKaRa Biomedical Technology；逆转录试剂盒购自罗氏公司；2×PCR Mix购自广州东盛生物科技有限公司；AXYGEN胶回收试剂盒购自康宁生命科学有限公司；链霉素、青霉素、胎牛血清购自Gibco公司。

1.2 临床样品采集与处理2016年6月至2019年3月，主要从山东省泰安、菏泽、济宁、枣庄等16个地市的126个猪场搜集疑似PED临床病例231份，剖检病死猪采集胃、肠道、淋巴结、粪便等病料。绝大多数猪场均进行过PEDV疫苗CV777株接种，发病猪群主要表现发热、呕吐、水样腹泻、体质量减轻和脱水，并有较高的病死率。病死猪剖检主要表现为小肠壁变薄呈透明状，肠腔内有黄白色浆液样内容物，小肠黏膜有不同程度的充血或者出血，空肠系膜淋巴结充血肿胀等。取胃、肠、淋巴结等器官组织一部分固定用以制作石蜡切片；一部分加入无菌PBS(1 mL/g)，置于高通量组织研磨器中研磨，将研磨液经12 000 r/min，4℃离心15 min后，进行RT-PCR初步检测，取上清液经直径0.22 μm滤器过滤然后分装，置-80℃冰箱保存备用。

1.3 病原鉴定将冻存的研磨液上清提取核酸，根据不同引物(表1)进行RT-PCR扩增鉴定。

表1 病原检测引物序列

1.4 S基因的序列测定及系统发育分析按照AXYGEN胶回收试剂盒步骤进行PCR产物的回收纯化，回收产物通过与pMD18-T载体进行连接转化后，由上海生工有限公司测序。测序结果利用Medlign、Mega X等软件与GenBank中登陆的PEDV参考株序列(表2)进行核苷酸序列、氨基酸序列、抗原表位结构域和抗原表位等的分析。

表2 PEDV S 基因参考株信息

2 结果

2.1 仔猪腹泻病料病毒检测结果采用PCR/RT-PCR方法对231份腹泻样品进行病原检测。231份仔猪腹泻样品中PEDV检出率为63.20%(146/231)，其次为PCV2，检出率为16.88%(39/231)，PoRV检出率为5.19%(12/231)，TGEV检出率为0.43%(1/231)，混合感染率为0.43%(1/231)，为PEDV和TGEV感染。结果表明山东省仔猪腹泻主要源于PEDV感染，其次PCV2感染所致的肠炎也是造成仔猪腹泻的重要原因之一。

2.2 典型病例病理学观察结果病死猪严重脱水，消瘦，眼球深陷，股内侧灰绿色粪便污染(图1A)。剖检病死猪可见胃扩张，充满白色或黄色凝乳样内容物，胃黏膜不同程度的充血、出血，小肠壁变薄呈透明状，肠腔内灰白色或者黄白色浆液样亦或者水样内容物(图1B)，小肠黏膜有不同程度的充血或者出血，空肠系膜淋巴结充血肿胀(图1C)；部分病猪肾脏表面可见散在的点状出血。镜检病变主要表现胃肠黏膜呈急性卡他性或出血性卡他性炎症，以空肠病变最为严重，小肠绒毛缩短，黏膜上皮细胞坏死脱落，黏膜固有层充血、出血(图1D～H)。免疫组织化学检测在小肠黏膜上皮细胞胞浆内可见病毒阳性颗粒，其他组织病毒阳性颗粒较少。

A.病死猪严重脱水，消瘦，眼球深陷；B.小肠壁变薄呈透明状，肠腔内有黄白色浆液样内容物；C.小肠黏膜有不同程度的充血或者出血，空肠系膜淋巴结充血肿胀；D.肠绒毛缩短，100×；E.黏膜上皮细胞变性坏死，固有层充血出血(200×)；F.肠绒毛萎缩，黏膜固有层充血(100×)；G.黏膜上皮细胞坏死脱落，固有层血管充血(200×)；H.黏膜下层充血、水肿(100×)；I.黏膜上皮细胞PEDV免疫组化染色阳性(200×)

2.3 PEDV S基因同源性分析通过分段测序并拼接，共获得7株来自山东不同地区的PEDV S基因的全基因序列(表3)。将分离株核苷酸和氨基酸序列与从GenBank中登陆的22株国内外参考毒株进行了同源性分析比较(表4)。结果表明，7株本研究分离株间核苷酸和氨基酸同源性分别为96.8%～100.0%和95.9%～100.0%，与疫苗株CV777的核苷酸和氨基酸同源性分别为93.3%～93.6%和91.8%～92.8%。

表3 本研究中 PEDV 流行株样品信息

表4 PEDV-S基因同源性比较 %

2.4 PEDV S基因核苷酸突变分析将7株PEDV分离株与中国现在使用的疫苗株CV777进行了分析比较，结果发现分离株与疫苗株CV777均存在着不同程度的碱基突变现象，并且均有不同位点的碱基缺失与插入现象。分离株在167 bp有1个碱基插入，175～180 bp有5个碱基插入，181～187 bp 有6个碱基插入，413～417 bp有3个碱基插入;在218 bp有1个碱基缺失，470～473 bp有3个碱基插入，474～480 bp有6个碱基缺失(图2)，表明本研究分离株与疫苗株相比已发生变异。

图2 PEDV S基因核苷酸分析比较

2.5 PEDV S基因氨基酸序列、抗原表位域及抗原表位突变分析将7株PEDV分离株氨基酸序列与疫苗株CV777进行了对比分析，结果发现7株分离株均存在氨基酸突变，在aa59～aa62位有连续4个氨基酸(QGVN)插入，aa140有1个氨基酸(N)插入，而在aa160有1个氨基酸(G)的缺失。

将7株PEDV分离株S蛋白上诱导中和抗体产生的抗原表位域(COE：aa499-aa638)及抗原表位(S1D5：PVLVYSNIGVCKSGSI，S1D6：SGSIGYVPSQSGQVKI)与CV777的S蛋白上对应区域进行分析，结果显示，7株分离株的COE序列没有氨基酸插入及缺失，但是均存在氨基酸位点突变，其中所有毒株共同存在4个位点突变，分别是A521S→，T553S→，G598S→，Q637E→，其余个别毒株存在不同的位点突变。S1D5表位中7株分离株完全保守，没有突变现象；S1D6表位存在两处共同突变位点(L768S→，D770S→) (图3)。结果表明，本研究分离株与疫苗株间氨基酸已存在大量突变，现有疫苗保护效果较差。

图3 PEDV S基因氨基酸分析与抗原表位域及抗原表位分析比较

2.6 PEDV S基因遗传进化分析将7株PEDV分离株的S基因核苷酸序列与GenBank中登陆的22株国内外参考株进行遗传进化分析，并绘制系统进化树(图4)。本研究分离株与参考株可分为GroupⅠ、GroupⅡ两大群，7株分离株均属于GroupⅠ，CV777、DR13和L00799-K11等参考株构成独立组群GroupⅡ组，其中SDXT、SDYT、SDLW、SDWF、SDTA和SDRZ位于同一大分支，与山东参考株SD2014、河南参考株CH-HNLH-2015和兰州参考株CH-SXXY-2017等国内参考株亲缘关系较近，与墨西哥参考株MEX104、美国参考株USA-Colorado和哥伦比亚参考株COL-Cundinamarca属于同一组群，有一定的亲缘关系。而所有分离株与疫苗株CV777亲缘关系均最远。结果表明山东地区当前PEDV流行株与疫苗株遗传距离远，差异较大。

3 讨论

近年来，PED一直是影响中国养猪业的重要传染病之一，给中国养猪业造成了重大经济损失。1995年起，中国先后使用了猪传染性胃肠炎、PED二联活苗和灭活苗，使免疫猪群得到了较好的保护[13-15]。然而自2006年以来，PEDV开始在中国免疫猪群中再度流行，尤其是自2010 年秋冬季节开始，该病形成变异株vPEDV，流行更加严重[15]。尽管目前中国山东省猪场采用了最新的猪传染性胃肠炎、PD和猪轮状病毒三联苗，但腹泻病情并没有得到有效的控制[16-17]。本研究收集的231份仔猪腹泻病料病原检测结果中，vPEDV感染而致病的比例最高(63.20%)，其次为PCV2 (16.88%)。由此可见山东省仔猪腹泻主要源于vPEDV感染，其次PCV2感染所致的肠炎也是造成仔猪腹泻的重要原因之一。

▲为本研究分离株；◆为疫苗株

本研究结果分析表明，PEDV仍是山东省仔猪腹泻的最主要病原，7株分离株S基因存在碱基的突变、插入和缺失，所编码的蛋白发生变异，分离株与PEDV参考菌株具有93.1%～98.9%的核苷酸和91.5%～98.7%的氨基酸同源性，与疫苗株CV777的核苷酸和氨基酸同源性分别为93.3%～93.6%和91.8%～92.8%，低于山东地区2014-2015年PEDV分离株S基因与CV777疫苗株同源性对比的93.5%～93.9%和92.2%～92.5%[17]，且与现有的CV777疫苗株亲缘关系较远同源性较低。当前山东省PEDV流行株存在明显变异，这是PED在免疫猪群中广为流行的主要原因。由此可见当前的疫苗免疫并不能完全保护猪群免受PEDV的攻击。因此，使用流行株作为疫苗株可能会有更好的保护力，取得更理想的免疫效果，使猪群免受PEDV的攻击。