DNA甲基化位点对肺腺癌预后的作用研究

刘颖方子晗张雅琴王可,3

1 广州市第一人民医院(广州 510180) 2 湖北文理学院基础医学院预防医学教研室(襄阳441053) 3 湖北文理学院附属襄阳市中心医院，临床循证与转化医学中心(襄阳441053)

肺癌是世界上最常见的癌症，也是癌症死亡的最常见原因[1]。作为肺癌的主要类型之一，非小细胞肺癌约占肺癌病例的85%，非小细胞肺癌以肺腺癌居多[2]。目前因早期诊断工具及常见的肿瘤标志物对非小细胞肺癌不敏感，导致肺腺癌预后相对较差，5年生存率不足15%[3-4]。因此，为提升肺腺癌病人的预后生活质量，探索与肺腺癌有关的生物标志物尤为重要。

表观遗传学改变与肺癌发病、病程加快相关，DNA甲基化(DNA methylation)是导致表观遗传学改变的关键因素，在细胞功能调控和癌变过程中占据重要作用[5-7]。研究表明，DNA甲基化通过调控lncRNA的表达从而影响肺癌的预后[8]。肿瘤基因组图谱(the cancer genome atlas，TCGA)含有大量肿瘤信息，为研究不同肿瘤共性、突变性、差异性情况提供机会[9]。本文从TCGA中选取肺腺癌甲基化数据，筛选与其预后相关甲基化位点，并评估肺腺癌病人预后情况，初步探索DNA甲基化在肺腺癌发生发展中的作用。

1 资料与方法

1.1 数据来源

本研究使用TCGA数据库(https://portal.gdc.cancer.gov/)对数据进行筛选，包括肺腺癌mRNA表达数据、甲基化数据和临床预后数据。2019年10月本研究在TCGA数据库下载肺腺癌mRNA表达数据和甲基化数据，其中具有癌组织和癌旁组织甲基化信息数据的合计26例，具有癌组织和癌旁组织mRNA表达数据的患者合计56例。经过数据连接处理后，具有癌组织甲基化芯片数据和mRNA表达数据的病人合计455例，具有临床预后信息和癌组织甲基化芯片数据的患者合计418例。

1.2 肺腺癌风险相关甲基化位点的筛选

在对组学数据进行预处理后，筛选差异性甲基化位点和差异性mRNA表达的基因(错误发现率(false discovery rate, FDR)<0.05且差异倍数(fold change)>2或<0.5)，并选择甲基化、mRNA表达水平具有显著性关联的甲基化位点进行后续分析(P<0.05且R2>0.2)。共筛选出158个差异性甲基化位点。

将418例肺腺癌病人随机分成两组，一组为探索人群(251人，60%)，一组为验证人群(167人，40%)。在探索人群中采用最小绝对收敛和选择算子(Least absolute shrinkage and selection operator, LASSO)筛选对肺腺癌风险有影响的甲基化位点，并在验证人群中对前期筛选出的甲基化位点进行结论验证。

1.3 相关甲基化位点与肺腺癌风险之间的关系

线性相关方法用于分析甲基化位点甲基化水平、肺腺癌之间的关联性，非条件Logistic回归模型评估甲基化位点与肺腺癌预后的关系。同时运用受试者工作特征曲线(receiver operating characteristic curve，ROC)分析评估甲基化位点对肺腺癌风险的预测效果。

1.4 统计学分析方法

应用GraPad Prism 5、SAS 9.4软件、R 3.3.0软件开展数据分析和绘图。t检验比较两样本均数差异，P<0.05为有统计学差异。

图1 本研究数据筛选流程图

2 结 果

2.1 纳入对象基本临床特征

符合条件的肺腺癌病人共有418例。研究人群平均年龄(65.10±10.14)岁，术后化疗病人152人(36.4%)、放疗病人88人(21.1%)，在随访结束时有102人死亡，占比24.4%。

2.2 肺腺癌风险相关甲基化位点的筛选结果

将418例肺腺癌病人随机分成两组，一组为探索人群(251人，60%)，一组为验证人群(167人，40%)。在对数据进行预处理后，根据筛选标准，最后共有158个甲基化位点在癌和癌旁组织中具有显著差异且与其所在基因mRNA表达显著相关。图2展示了使用LASSO回归的分析结果，当模型最优时，仅有cg19378330甲基化位点纳入模型。cg19378330在TCGA数据库的注释信息显示其所在基因为ABCC2。

图2 LASSO回归筛选与肺腺癌预后有关的甲基化位点

图3 56例肺腺癌病例的癌组织和癌旁组织中前50个差异表达基因热图情况

2.3 生物信息学分析

图3为前50个显著性差异甲基化位点和基因无监督聚类分析，结果显示在肺腺癌病人的癌和癌旁组织中，甲基化位点的甲基化水平及所在基因mRNA表达水平有较大差异。基因GO(Gene ontology)富集性分析显示，基因可以被分为23个功能聚类，其中有13个P<0.05的GO功能分类。主要参与G蛋白偶联受体介导的信号通路、细胞生长负调控蛋白等蛋白调控功能，膜的生物发生、膜筏组织调控等细胞相关功能，以及影响粘着斑结构功能等生物学过程(图4)。

图4 前50个差异甲基化位点基因GO分析结果

2.4 甲基化位点与肺腺癌风险的关联性分析

甲基化位点cg19378330的甲基化水平对肺腺癌死亡风险的影响见表1和表2。结果显示，在探索阶段人群中，位点cg19378330甲基化水平增加，肺腺癌死亡风险增高(OR=9.82, 95%CI=1.84～52.48)。甲基化位点水平高于中位数的患者，归入高风险组，甲基化位点低于中位数的为低风险组。结果发现与低风险组相比，高风险组的死亡风险比低风险组增加了38%(OR=1.38, 95%CI=1.16～2.69)。在验证人群中表现出相似结果。

表1 甲基化位点cg19378330的甲基化水平与肺腺癌之间的关系(探索人群)

表2 甲基化位点cg19378330的甲基化水平与肺腺癌之间的关系(验证人群)

2.5 甲基化位点与肺腺癌病人风险的预测价值评估

采用ROC曲线分析评估甲基化位点cg19378330对肺腺癌风险的预测效果结果显示，在探索阶段人群中其ROC曲线下面积(area under the curve，AUC)的结果为0.80(0.73～0.88)，灵敏度为86.2%。在验证人群中，甲基化位点cg19378330的甲基化水平与肺腺癌风险之间的关系更为显著(表2)。与低风险组肺腺癌病人相比，高风险组病人的风险明显增加(OR=3.62, 95%CI=1.53～8.56)。ROC曲线分析显示AUC为0.81(0.73～0.89)，灵敏度为90.1%。甲基化位点cg19378330与其所在基因ABCC2 mRNA表达水平之间的关系见图5。上述研究结果表明，甲基化位点cg19378330与肺腺癌具有较显著的关联性，且可以对肺腺癌的风险进行有效的预测。

图5 肺腺癌病人癌组织、癌旁组织中甲基化和基因mRNA表达水平

3 讨 论

本文利用TCGA公共数据库中肺腺癌有关数据，筛选出1个甲基化位点(cg19378330)与肺腺癌风险相关。依据甲基化位点中位数进行分组，高于甲基化位点水平中位数的，归入高风险组，低于甲基化位点中位数的为低风险组，高风险组死亡风险是低风险组的1.38倍。采用ROC曲线分析评估甲基化位点cg19378330对肺腺癌风险的预测效果结果显示，AUC为0.80，灵敏度为86.2%。且在验证人群中表现出类似结果。提示甲基化位点cg19378330与肺腺癌具有较显著的关联性，且可以对肺腺癌的风险进行有效的预测。

cg19378330位于10号染色体99840130-99840469的CpG岛序列，为基因ABCC2的gene body区。ABCC2全称为三磷酸腺苷结合盒转运体C2(ATP-binding cassette transporters C2, ABCC2)，是一种属于ABC转运体C亚家族的膜转运蛋白[10, 11]。ABCC2可以激活三磷酸腺苷酶，在水解ATP获取能量后将底物泵出，因此在药物吸收、分布、排泄过程中发挥重要作用[12]。同时，ABCC2基因在人体内存在着遗传变异现象，其多态性可影响肿瘤细胞编码蛋白的表达和功能[13]。有研究结果显示，ABCC2的基因过表达及变异情况可以作为预测非小细胞肺癌预后情况的有效生物标志物，且ABCC2的基因表达水平与非小细胞肺癌病人的化疗效果有关[14-15]。非小细胞肺癌最常使用铂类化疗，ABCC2蛋白转移铂类药物与还原型谷胱甘肽的结合物，降低细胞内药物浓度从而使非小细胞肺癌病人产生耐药，影响化疗效果[16-18]。在肺腺癌病人中，cg19378330位点显示为高甲基化状态，且与基因ABCC2的表达相关，结果表明cg19378330可能通过调节自身甲基化状态从而影响ABCC2基因的表达，进而影响肺腺癌的发病及预后。

本研究具有一定的创新性和科学价值。第一，在TCGA数据库选择有显著性差异的与肺腺癌风险相关的甲基化位点cg19378330，提出甲基化水平改变与肺腺癌风险之间存在潜在关联的研究假设，国内外未见此甲基化位点的类似报道；第二，通过对公共组学数据库进行挖掘，证明甲基化位点与肺腺癌预后风险的评估效果，研究结论可以为肿瘤的个性化治疗提供新的探索方向。

综上所述，通过TCGA数据库挖掘，筛选出肺腺癌相关的特异性甲基化位点cg19378330，且甲基化位点cg19378330对肺腺癌病人的预后有较好预测价值，为肺腺癌预后提供更多可供选择的标志物。