基于SCF/c-kit信号通路探讨调胃承气汤对脑出血急性期大鼠胃肠组织的影响

杨雪琳，唐 明，周立娟，修小惠，安朋朋，王佳宁

(1.山东中医药大学，山东 济南 250014；2.海慈医疗集团，山东 青岛 266011)

胃肠动力障碍是脑出血急性期常见的并发症之一，其发病率高达61.8%～80%[1-2]，可导致胃肠内容物蓄积，胃肠菌群失调，释放大量内毒素，进而使胃肠功能衰竭，加重恶化脑出血患者的整体病情[3-4]。因此，早期干预治疗脑出血后胃肠动力障碍具有非常重要的意义。近年来，随着脑肠轴理论的提出，从胃肠方面治疗脑病逐渐被重视[5]。早在《中藏经》中即有运用通腑法治疗卒中的记载，金元四大家刘完素亦提出对于“内有便溺之阻格”之中风可以运用调胃承气汤以荡涤积滞[6]。课题组前期研究证实调胃承气汤可以促进脑出血急性期患者颅内血肿的吸收，缓解神经功能缺损症状[7]；可以增强胃肠动力[8]，保护胃肠黏膜[9]；可以清理肠道，调节肠道菌群[10]，降低血浆大肠杆菌内毒素水平[11]，减轻卒中后内毒素对机体的损害。但是调胃承气汤促进胃肠平滑肌收缩、调节胃肠动力的具体作用机制尚不明确，因此本研究拟通过观察调胃承气汤对脑出血急性期模型大鼠胃肠组织中c-kit、SCF蛋白及mRNA表达的影响，初步探索调胃承气汤改善胃肠动力的作用机制。

1 实验材料与方法

1.1实验动物 健康雄性清洁级Wistar大鼠40只，10周龄，体重(200±20)g，由山东中医药大学实验中心提供，动物许可证号：SCXK(鲁)2019-0002。动物自由进食、饮水，喂养标准颗粒饲料，室温25 ℃，相对湿度60%，适应性喂养1周。实验流程和大鼠处理过程遵循动物实验管理条例。

1.2实验药物及制备 调胃承气汤组方：大黄12 g、甘草6 g、芒硝9 g，中药采用颗粒剂，转换为颗粒共12.6 g，均购于北京康仁堂药业有限公司。参照《药理实验方法学》中人与动物等效剂量换算公式，计算出大鼠中药的等效剂量为1.134 g/(kg·d)，加入适量蒸馏水配成113.4 mg/mL的悬浊液，于4 ℃保存备用。枸橼酸莫沙必利片由鲁南贝特制药有限公司生产，规格：5 mg/片，加入适量蒸馏水制备成0.135 mg/mL的悬浊液，于4 ℃保存备用。

1.3实验试剂与仪器 c-kit抗体(中国wanleibio，批号：WL00125)；SCF抗体(中国wanleibio，批号：WL02436)；全蛋白提取试剂盒、BCA蛋白浓度测定试剂盒、ECL发光液以及Western洗涤液(中国wanleibio)；Super M-MLV 反转录酶、TRIpure裂解液(北京BioTeke)；石蜡切片机(德国Leica)；WD-9405B水平摇床、DYY-7C电泳仪、DYCZ-40D转移槽(北京六一公司)；Exicycler 96荧光定量PCR仪(韩国BIONEER)；紫外分光光度计(美国Thermo)。

1.4动物建模、分组及干预 将大鼠按照随机数字法分为假手术组、模型组、西药组、中药组，每组10只。假手术组只进针不注入(作为对照以排除进针损伤颅脑组织对实验结果产生的影响)；其余组大鼠参考文献[12],采用自体血注入法制备大鼠脑出血模型，根据神经功能缺损症状，按照Longa五级评分法，以1～3分大鼠为造模成功的标准。建模成功后即刻，中药组和西药组分别给予113.4 mg/mL的调胃承气汤悬浊液和0.135 mg/mL的莫沙必利悬浊液10 mL/(kg·d)灌胃，假手术组和模型组予以等容量生理盐水灌胃，2次/d，均连续灌胃7 d。

1.5观察指标及测定方法

1.5.1胃肠组织中c-kit、SCF蛋白表达情况 采用Western blot法检测。常规处死大鼠，分别切取胃、小肠、大肠、盲肠，提取总蛋白，用BCA法测定蛋白浓度。然后经过SDS-PAGE凝胶电泳，转移蛋白到PVDF 膜，封闭，卵育一抗，卵育二抗，ECL底物发光，将胶片结果扫描进计算机，用凝胶图像处理系统(Gel-Pro-Analyzer软件)分析目标条带的光密度值。结果用c-kit、SCF条带平均光密度/β-actin条带平均光密度表示。

1.5.2胃肠组织中c-kit、SCFmRNA表达情况采用RT-PCR法检测。取各组大鼠胃、小肠、大肠、盲肠组织样本，应用TRIpure裂解液提取样本总RNA，运用电泳和紫外分光光度法检测RNA浓度，反转录RNA得到cDNA，将cDNA加入到RT-PCR反应体系中,进行扩增，运用ExicyclerTM 96荧光定量仪进行荧光定量分析。引物序列及长度：c-kit 上游5’-TGCCCGAAACAAGTCATCTC-3’，下游5’-TGAGGGTTCAACTTTATCCACAT-3’，产物长度109 bp；SCF上游5’-GATAACCCTCAACTATGTCG-3’，下游5’-TTACTCAAGCCTTCAGAAAT-3’，产物长度135 bp；β-actin 上游5’-GGAGATTACTGCCCTGGCTCCTAGC-3’，下游5’-GGCCGGACTCATCGTACTCCTGCTT-3’，产物长度155 bp。采用2-ΔΔCT法计算各组织中c-kit和SCF mRNA表达量。

2 结 果

2.1各组大鼠胃肠组织中c-kit、SCF蛋白表达情况 模型组大鼠胃、小肠、大肠、盲肠平滑肌组织中c-kit、SCF蛋白相对表达量均明显低于假手术组(P均<0.05)，西药组、中药组大鼠胃肠各组织中c-kit、SCF蛋白相对表达量均明显高于模型组(P均<0.05)，西药组和中药组各指标比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。见图1及表1、表2。

表1 假手术组和脑出血急性期各组大鼠胃肠组织中c-kit蛋白相对表达量比较

表2 假手术组和脑出血急性期各组大鼠胃肠组织中SCF蛋白相对表达量比较

2.2各组大鼠胃肠组织中c-kit、SCFmRNA表达情况 模型组大鼠胃、小肠、大肠、盲肠平滑肌组织中c-kit、SCFmRNA相对表达量均明显低于假手术组(P均<0.05)，西药组、中药组大鼠胃肠各组织中c-kit、SCFmRNA相对表达量均明显高于模型组(P均<0.05)，西药组和中药组各指标比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。见表3及表4。

表3 假手术组和脑出血急性期各组大鼠胃肠组织中c-kit mRNA相对表达量比较

表4 假手术组和脑出血急性期各组大鼠胃肠组织中SCF mRNA相对表达量比较

3 讨 论

脑出血属于中医理论中“中风”的范畴，《金匮要略》中指出中风有“中脏”、“中腑”之分，中脏多偏里、中腑多偏表，清代医家沈金鳌认为大便秘结是中风病邪入里的标志，故急性脑出血伴半身不遂、昏迷、便秘、舌苔黄腻者辨证多属中风偏里之中脏，其发病机制与机体气血逆乱、升降失调有关。气血逆乱上冲于脑，神窍阻闭，故猝然昏扑，不省人事；气机失调，枢机不利，影响脾之升清、胃之降浊，气机更加壅滞，肠腑传导不畅，腑气不通，故大便秘结；加之痰浊、瘀血、火热等邪气壅滞胃肠道，实邪瘀积肆虐，继而加重患者的整体病情[13]。正所谓“急则治其标”“上病下取”，故对于腑实不通的急性脑出血患者，在辨证论治的基础上选用通腑法治疗，可以泄逐壅滞、祛邪外出，使气血调畅，神志清明，达到诸症皆缓的疗效。

现代研究发现，脑出血急性期胃肠动力的改变由中枢及胃肠道神经系统的共同调节而致，胃肠道神经系统的调节主要与Cajal间质细胞(ICC)有关。ICC存在于胃肠神经与平滑肌细胞之间[14]，可以整合胃肠神经信息传递至平滑肌细胞，起搏胃肠道的慢波活动[15]，调控胃肠节律性运动[16]，ICC的数量以及形态结构的改变是影响胃肠道动力的直接因素。c-kit受体(CD117)是ICC的特异性标志物，SCF则是c-kit的天然配体，当两者结合形成二聚体后，迅速发生磷酸化会激活SCF/c-kit信号通路，并通过相应的转导途径影响ICC的增生、分化以及表型的维持[17]。机体在毒物刺激、应激、缺氧、炎性介质等外源性因素影响下，c-kit表达会下降，SCF/c-kit信号通路异常改变，ICC数目相应减少、细胞分化也相对不完整，胃肠动力发生障碍；当c-kit表达恢复后，ICC的数目和分化程度可恢复，胃肠动力障碍亦有恢复[18]。因此，从SCF/c-kit信号通路研究胃肠运动障碍性疾病已成为一个崭新的方向[19]。

本实验结果显示，模型组大鼠胃、小肠、大肠、盲肠平滑肌组织中c-kit、SCF蛋白及mRNA表达量均明显下降；调胃承气汤及沙莫必利干预后，大鼠胃肠道组织中上述指标均明显升高。该结果表明脑出血急性期大鼠在机体的应激反应下或由于机体内毒素的增多，导致SCF/c-kit信号通路相关蛋白、基因表达异常，进而影响胃肠运动；而调胃承气汤可以通过对c-kit、SCF蛋白及mRNA表达的调节，恢复脑出血急性期大鼠胃肠SCF/c-kit信号通路，促进ICC的发育和分化，进而促进胃肠蠕动，改善胃肠动力障碍。然而脑出血急性期胃肠动力障碍的原因有很多，调胃承气汤是否可以通过调节中枢神经系统改善脑出血急性期胃肠动力障碍，以及调胃承气汤对ICC的数量及超微结构的具体影响等均有待进一步研究。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突。