钛种植体愈合期牙龈炎性浸润及巨噬细胞极化的研究

张照欣 王新革 葛泽阳 黄石头 李德华

种植体周围炎(peri-implantitis, PI)是一种以结缔组织炎症及进行性边缘骨吸收为病理特征的种植体生物学并发症，其具体发病机制目前尚存在争议[1-2]。Donath等[3]曾指出种植体与机体并非惰性结合的关系而是产生一定程度的异物反应。Albrektsson等[4]也认为状态稳定的种植体其实是一种异物反应平衡的表现，其周围长期保持炎性反应并产生免疫调节活动，巨噬细胞则是免疫调节活动的核心，全身及局部因素的刺激可导致免疫调节失衡而产生边缘骨吸收。

有研究分析了骨结合过程中的免疫细胞参与特征，结果表明与窝洞自我愈合过程相比，钛种植体可增强骨骼组织巨噬细胞等免疫细胞的活动[5]。而种植体周围软组织愈合过程中机体与材料之间的生物学事件以及免疫细胞的参与情况目前尚不明确。龈沟内以及种植体基台界面微生物的存在也为免疫细胞的研究带来干扰[6-7]。本实验通过植入埋入式种植体，观察在无细菌干扰的情况下钛种植体表面牙龈愈合过程中免疫细胞的参与情况，为探讨种植体周围软组织内的免疫环境提供依据。

1 材料与方法

1.1 基本材料

1.1.1 实验动物 20 只SPF级雄性SD大鼠(第四军医大学动物中心提供)， 7 周龄，体质量150～170 g。

1.1.2 主要试验仪器与试剂 口腔种植机(西诺普公司，瑞士)；牙科低速手机(NSK，日本)；定制钛螺钉样种植体(直径1.6 mm，长度2.3 mm，西安中邦公司)；戊巴比妥钠(西安第四军医大学口腔动物实验中心)；实时定量 PCR 试剂盒、cDNA 反转录试剂盒 (Takara，日本)；CD206小鼠来源单克隆抗体(1/300)、Nos2小鼠源性单克隆抗体(1/300)、 CD68兔源性单克隆抗体(1/200， Santa，美国)；水浴生物组织包埋机(武汉俊杰电子有限公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 分组 将20 只SD大鼠随机分为4 组，每组5 只。种植体植入后1、 4、 6 周各一组，每只大鼠左侧上颌第一磨牙区域作为实验侧，右侧建立同体对照，另有5 只不作处理作为空白对照。

1.2.2 拔除上颌第一磨牙 SD大鼠称重后按45 mg/kg的剂量腹腔注射3%戊巴比妥钠行全身麻醉。仰卧位固定大鼠，常规铺巾，探针分离牙龈后蚊式止血钳夹持第一磨牙颊舌面牙颈部轻微摇晃，待牙齿松动后颊侧脱位，拔除双侧第一磨牙。

1.2.3 种植体植入 愈合4 周后， 3%戊巴比妥钠行大鼠全身麻醉。于左侧牙槽嵴顶切开翻瓣暴露骨面，生理盐水冷却下逐级扩孔至1.2 mm。使用螺丝刀将钛钉植入种植窝内，严密缝合(图 1)。于右侧切开黏骨膜瓣，翻瓣后缝合作为同体对照。术后5 d拆线。

图 1 种植体及操作要点

1.2.4 取材 于实验组种植体表面、对照组翻瓣区域黏膜愈合处作5 mm×3 mm方形切口直达硬组织表面，剥离并切取黏膜。多聚甲醛溶液固定。

1.2.5 石蜡包埋及HE染色观察 组织标本酒精逐级脱水，放入二甲苯透明，浸蜡，颊舌向包埋。蜡块连续切片，厚度3 μm。常规二甲苯、梯度酒精脱蜡至水，HE染色，中性树胶封片。光镜下观察组织学表现，感兴趣区域为软硬组织界面，随机挑选3 个200 倍镜下视野，使用ImageJ软件进行炎细胞计数。

1.2.6 qRT-PCR分析牙龈组织各细胞因子基因表达 检测IL-1β、TNF-α、IL-10、TGF-β、IL-4、IL-13等细胞因子在牙龈组织内表达水平。各细胞因子目的基因及相应内参基因的引物序列如表 1所示，合成引物。取材时切取部分软组织标本，置于液氮中5～10 min后取出，研磨成粉末状，提取总RNA，计算各组细胞因子表达水平。

表 1 引物序列

1.2.7 免疫荧光染色 双重免疫荧光法标记牙龈组织中不同表型的巨噬细胞。取连续脱钙切片，二甲苯、梯度酒精脱蜡至水，加一抗于湿盒内4 ℃孵育，NOS2与CD68抗体共标鉴别M1型巨噬细胞，CD206与CD68抗体共标鉴别M2型巨噬细胞。隔日添加荧光二抗，避光孵育2 h, DAPI标记细胞核。感兴趣区域为软硬组织界面，共聚焦显微镜拍照，阳性细胞计数。

1.3 统计学分析

用SPSS 19.0 软件对数据进行统计分析，组间比较用 One-way ANOVA，P<0.05 即统计学上具有显著性差异。

2 结 果

2.1 组织学观察及炎细胞计数

HE染色观察到种植体表面牙龈组织内呈现较高密度的炎细胞浸润区域。在愈合过程中，浸润密度有不同程度降低(图 2)。炎细胞计数结果显示，口腔伤口愈合， 6 周后已与正常组织无明显差异，而实验组的炎细胞浸润数量始终高于对照组。愈合6 周后，种植体顶端的软组织内呈现明显的纤维增生(图 3)。

2.2 种植体对牙龈组织巨噬细胞极化的影响

M1、 M2型巨噬细胞均可在不同时间点被检出(图 4)。阳性细胞计数显示，实验组各型巨噬细胞在不同时间点均表现出较对照组更高的浸润程度。比较各组M2/M1比值显示，愈合后4 周、 6 周时间点，实验组M2/M1比值高于对照组及正常牙龈组织(P<0.05)。(图 5)表明种植体表面的牙龈愈合伴随明显的巨噬细胞活动增强,呈现出M2型极化趋势。

图 5 阳性细胞计数统计结果

2.3 种植体可影响牙龈组织内细胞因子表达

各组牙龈标本细胞因子的mRNA相对表达量如图所示。结果表明，IL-1β、 TNF-α等促炎因子在种植体周围牙龈内的表达水平低于对照组，而在第4 周开始， IL-10、 TGF-β等与抗炎、促进修复功能相关的细胞因子，以及IL-13、 IL-4等细胞融合相关因子表达水平则高于对照组(图 6)。

图 6 不同愈合时间细胞因子表达情况

3 讨 论

研究表明，巨噬细胞等免疫细胞及其分泌的细胞因子可直接或间接影响骨改建[8]。因此，牙龈组织内免疫环境与其所在部位的牙槽骨状态密切相关。而钛种植体在牙龈组织内产生的特殊免疫活动尚缺乏明确研究。Berglundh等[9]曾通过动物实验得出结论，在菌斑控制良好的情况下种植体周围结缔组织内无炎细胞浸润。而免疫学的观点认为生物材料植入体内必将引起宿主异物反应并介导免疫细胞广泛参与[10]。对此Trindade等[11]则提出，骨结合其实是异物反应平衡的表现形式，以材料周围的慢性炎性反应为特征。本研究发现在6 周的愈合过程中牙龈内均可呈现沿种植体界面的高密度炎性浸润带，而口内创口在6 周即可恢复正常水平，提示种植体的存在可使牙龈组织内发生持续存在的免疫活动。Yuan等[12]也曾在植入后3周观察到种植体周围软组织较高程度的炎细胞表达。本实验通过埋入式愈合设计并延长愈合时间进一步排除细菌、伤口恢复等因素对免疫细胞浸润所带来的影响。此外，愈合后6 周种植体顶端牙龈可见广泛增生的胶原纤维。有研究认为持续的慢性炎性反应与纤维增生相关[13]，而异物反应也可促使机体在材料周围产生纤维包裹使其与正常组织相分隔[10]。因此，组织内免疫细胞的参与并不代表牙龈发生了慢性炎症病变。

单核-巨噬细胞系统是固有免疫系统的重要组成部分，因其功能可塑性在不同的微环境影响下向M1、M2等表型极化[14]，可在伤口愈合、组织修复过程中起重要作用[15]。免疫荧光染色显示，与正常伤口愈合相比种植体表面的牙龈组织在愈合过程中不仅展现出更高的巨噬细胞浸润程度，而且呈现出更为明显的M2极化趋势。不仅M2型巨噬细胞浸润程度高于对照组，在愈合后4 周、 6 周M2/M1的比值亦高于对照组。这与骨结合过程中巨噬细胞的极化状态相类似，Trindade等[16]曾研究发现骨结合部位上调的巨噬细胞参与M2型极化，可在愈合后期参与更加活跃的组织修复及再生活动。

小鼠体内研究发现异物植入皮下可发生异物反应并抑制组织内促炎型细胞因子表达，产生局部免疫抑制的微环境[17]。本实验首次探究牙龈在钛表面愈合过程中细胞因子表达特点，显示IL-1β、TNF-α等促炎因子显著下调，IL-10、TGF-β等抗炎、促进修复相关的细胞因子表达上调，与小鼠皮下异物周围的免疫环境高度类似。此外，牙龈愈合4 周、 6 周观察到IL-4、IL-13表达水平显著增强。这两者已被体内、体外实验证明具有诱导巨噬细胞融合的作用[18]，并且可被作为巨噬细胞M2方向极化的诱导因子[19]。提示牙龈愈合后期种植体表面组织内发生较高程度的巨噬细胞融合活动，而巨噬细胞融合成为异物巨细胞被认为是异物反应的标志之一。

综上，钛种植体表面的牙龈愈合可产生一定程度的异物反应，增强局部免疫活动，表现为较高程度的炎性浸润及巨噬细胞M2型极化趋势，产生利于组织修复的免疫微环境。随着时间的进一步延长免疫系统的活动特征是否发生改变以及该免疫微环境与边缘骨吸收之间的关系有待进一步研究。