破壁灵芝孢子铁皮石斛粉对小鼠免疫功能的影响

2022-06-16岑思恩焦春伟随晶晶陈家明谢意珍

食用菌 2022年3期

岑思恩焦春伟* 随晶晶陈家明谢意珍，2

（1广东粤微食用菌技术有限公司，广东广州510663；2广东粤微生物科技有限公司，广东广州510663）

铁皮石斛Dendrobium officinale，是兰科石斛属多年生草本植物，其活性成分包括多糖、生物碱、黄酮、挥发油等；具有增强免疫力、抗氧化、降尿酸、抗肿瘤、抗疲劳、降血糖等药理作用[1-3]。由于野生铁皮石斛数量较少，价格昂贵，故目前铁皮石斛相关产品多是复方制剂。铁皮石斛通常与西洋参、灵芝、枸杞配伍使用。检索国家市场监督管理总局特殊食品信息查询平台，截至2022 年1 月，获批准的以铁皮石斛为原料的保健食品共129 款，其中铁皮石斛与灵芝配伍使用产品共11款，配伍频次仅低于西洋参，且获批功能均为增强免疫力，可见铁皮石斛与灵芝复配具有增强免疫力功效，已获得专家及市场的一致认可。灵芝Ganoderma lucidum，是担子菌纲多孔菌科灵芝属真菌，灵芝孢子（Sporoderm-Broken Spore ofGanoderma lucidum）是灵芝成熟期释放出的卵型生殖细胞，富含多糖、三萜和核苷等多种功效成分，具有抗肿瘤、抗氧化、免疫调节等药理作用[4-6]。灵芝孢子中部分活性物质如总三萜、总多糖含量明显高于灵芝子实体，同时在抗肿瘤、抗氧化、增强免疫力等方面表现出更加明显的效果[7]。因灵芝孢子具有坚硬的孢壁，孢子内有效成分难以通过孢壁溶出而被人体吸收利用，其开发和应用受到限制。得益于现代工艺的发展，通过破壁技术可有效地将孢壁打碎，使活性成分更易释放，从而破壁灵芝孢子逐渐受到市场的关注[8-9]。

破壁灵芝孢子及铁皮石斛同属补益药，有良好的保健食品开发前景。随着中药化学和药理学的发展，多项动物试验和人群试验已验证了破壁灵芝孢子粉及铁皮石斛都具有増强免疫功能的作用[10-15]。目前，已有针对破壁灵芝孢子粉或铁皮石斛单味中药进行深入而细致的研究，但对于破壁灵芝孢子及铁皮石斛复配组方的免疫功能的研究鲜有报道。破壁灵芝孢子铁皮石斛粉是以破壁灵芝孢子和铁皮石斛组成的复方制剂，笔者参考卫生与健康委员会（原卫生部）《保健食品检验与评价技术规范》（2003 年版）[16]对其增强免疫力作用进行研究，为其推广应用提供数据依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

（1）试验样品：破壁灵芝孢子铁皮石斛粉样品由广东粤微食用菌技术有限公司提供，由铁皮石斛经灭菌、干燥、粉碎后，与破壁灵芝孢子粉混合而成。样品含粗多糖6%（硫酸-苯酚法）及总三萜4%（香草醛-冰醋酸显色法）。人体每日推荐食用量为2 g。试验前将样品用纯净水配制成各剂量。

（2）试验动物：SPF级昆明种健康小鼠，体重18~22 g，由广东省医学试验动物中心提供，合格证号SCXK（粤）2013-0002，饲料由广东省医学试验动物中心提供。所有动物均饲养于广东省疾病预防控制中心屏障环境中，使用许可证号SCXK（粤）2013-0011，饲养环境条件为室温20~26 ℃，空气相对湿度40%~70%。

（3）仪器与试剂：CO2培养箱[赛默飞世尔科技（中国）有限公司，HERAcell 240i]，CASY 细胞计数仪（德国Innovatis 公司，CASY-DT），酶标仪（美谷分子仪器（上海）有限公司，SOFTmaxPRO），超净工作台（苏州安泰空气技术有限公司，SW-CJ-2F），分光光度计（日本岛津公司，UV-2550），倒置显微镜（上海徕卡显微镜有限公司，XDP-12），显微镜（日本OLYMPUS 公司，CX31），游标卡尺，RPMI1640 培养基，绵羊红细胞，MTT和ConA等。

1.2 试验方法

试验小鼠在实验室条件下检疫3 d 后，随机分为4 批，每批40 只。第1 批用于迟发型变态反应试验和血清溶血素测定；第2 批用于脾淋巴细胞转化试验、脾淋巴细胞抗体生成试验及NK 细胞活性试验；第3 批用于碳廓清试验；第4 批用于腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞试验。

每批动物随机分为低、中、高3个剂量组及阴性对照组，每组10 只小鼠。低、中、高剂量分别为0.17 g/（kg BW）、0.33 g/（kg BW）、1.00 g/（kg BW）（相当于人体日推荐量的5 倍、10 倍、30 倍），每天按0.2 mL/10 g BW 量灌胃给样，阴性对照组灌胃同等的纯净水。给样量根据每周体重增减调整，试验周期为4周。

参考卫生与健康委员会（原卫生部）《保健食品检验与评价技术规范》（2003 年版）[16]的方法进行脏器指数的测定、ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞转化试验（MTT法）、迟发性变态反应（足跖增厚法）、抗体生成细胞检测（Jerne 改良玻片法）、血清溶血素的测定（半数溶血值法）、小鼠碳廓清实验、小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞试验（滴片法）、NK细胞活性测定。

1.3 统计分析

2 结果与分析

2.1 破壁灵芝孢子铁皮石斛粉对小鼠脏器指数的影响

胸腺是T 淋巴细胞分化成熟的部位，脾脏是机体内最大的外周免疫器官[17]，免疫功能低下时胸腺、脾脏萎缩，体积变小[18]。因此，胸腺指数和脾脏指数是表征机体免疫功能的重要指标。由表1 可知，各剂量组小鼠的脏器/体重比值与阴性对照组比较，均无显著性差异（P＞0.05），表明破壁灵芝孢子铁皮石斛粉对小鼠的脾脏指数和胸腺指数无明显影响。

表1 小鼠脏器指数测定结果（±s，n=10）

2.2 破壁灵芝孢子铁皮石斛粉对小鼠迟发型变态反应的影响

迟发型变态反应属于IV 型变态反应，其组织损伤机制是由特异性致敏T 细胞所介导，体现机体的细胞免疫功能[19]。由表2 可知，与阴性对照组比较，各剂量组小鼠的足跖增厚值均升高，中、高剂量组足跖增厚值具有显著性差异（P＜0.05），表明破壁灵芝孢子铁皮石斛粉具有促进小鼠的迟发型变态反应的作用。

表2 小鼠迟发型变态反应试验结果（±s，n=10）

注：*表示与阴性对照组比差异显著，P＜0.05。

2.3 破壁灵芝孢子铁皮石斛粉对ConA 诱导的小鼠脾淋巴细胞转化试验的影响

脾淋巴细胞转化率是反映机体细胞免疫的基本指标，通过检测淋巴细胞转化率可以了解试样对机体免疫功能的影响[20]。当T 淋巴细胞受ConA 刺激后发生增殖反应，增殖细胞中的线粒体水解酶可将MTT（一种淡黄色的唑氮盐）分解成紫色结晶，通过测定光密度值能反应细胞增殖情况[16]。由表3 可知，各剂量组光密度差值与阴性对照组比较，差异均无显著性意义（P＞0.05），表明破壁灵芝孢子铁皮石斛粉对小鼠的脾淋巴细胞转化能力无影响。

表3 小鼠脾淋巴细胞转化试验结果（±s，n=10）

2.4 破壁灵芝孢子铁皮石斛粉对血清溶血素的影响

血清溶血素是B淋巴细胞接触红细胞后产生的特异性抗体，接触特异性抗原绵羊红细胞后，其水平反映机体释放特异性抗体的能力，能够评价体液免疫功能的状态[21]。由表4 可知，各剂量组小鼠的半数溶血值均高于阴性对照组，且中剂量组与阴性对照组的差异显著（P＜0.05），表明破壁灵芝孢子铁皮石斛粉具有提高小鼠血清溶血素水平的作用。

表4 小鼠血清溶血素测定结果（±s，n=10）

注：*表示与阴性对照组相比差异显著，P＜0.05。

2.5 破壁灵芝孢子铁皮石斛粉对小鼠脾淋巴细胞抗体生成水平的影响

抗体生成细胞由B 淋巴细胞分化产生，能产生各种免疫球蛋白，介导体液免疫[22]。由表5 可知，各剂量组的溶血空斑数与阴性对照组比较，差异均无显著性（P＞0.05），表明破壁灵芝孢子铁皮石斛粉对小鼠脾淋巴细胞抗体生成水平无影响。

表5 抗体生成水平测定结果（±s，n=10）

2.6 破壁灵芝孢子铁皮石斛粉对小鼠碳廓清吞噬功能的影响

单核巨噬细胞吞噬能力是评价非特异性免疫功能的重要指标，其经典的试验方法为碳廓清法[23]。当印度墨汁中的颗粒状异物注入血液后，大部分异物迅速被肝脏和脾脏中的巨噬细胞所吞噬。碳廓清试验中测得的碳廓清指数可以反映碳粒的清除速率，吞噬系数反映的是每单位量的组织吞噬活性[24]。由表6可知，各剂量组的碳廓清吞噬指数均高于阴性对照组，且中、高剂量与阴性对照组有显著性差异（P＜0.05），表明破壁灵芝孢子铁皮石斛粉具有促进小鼠的单核-巨噬细胞碳廓清功能的作用。

表6 小鼠碳廓清试验结果（±s，n=10）

注：*表示与阴性对照组相比差异显著，P＜0.05。

2.7 破壁灵芝孢子铁皮石斛粉对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞功能的影响

巨噬细胞具有很强的吞噬杀伤能力，是参与机体非特异性免疫防御的重要免疫细胞，巨噬细胞最突出的作用是清除受伤后的组织碎片和发育过程中的凋亡细胞，消灭入侵的病原体，是机体免疫保护机制之一[25]。利用巨噬细胞吞噬鸡红细胞试验可以在体外观察巨噬细胞的吞噬功能。由表7 可知，各剂量组小鼠的腹腔巨噬细胞对鸡红细胞的吞噬百分率转换值及吞噬指数指标与阴性对照组比较，均无显著性差异（P＞0.05），表明破壁灵芝孢子铁皮石斛粉对小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬能力无影响。

表7 小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞试验结果（±s，n=10）

注：吞噬百分率转换值X=Sin-1（p）1/2。

2.8 破壁灵芝孢子铁皮石斛粉对小鼠NK 细胞活性的影响

NK 细胞是机体固有免疫系统的重要组成部分，具有免疫清除和免疫监视的功能。只有活化的NK 细胞才能扩散、浸润至感染源，故NK 细胞活性是评价机体免疫力的重要指标[26]。由表8 可知，各剂量组小鼠的NK 细胞活性与阴性对照组比较，均无显著性差异（P＞0.05），表明破壁灵芝孢子铁皮石斛粉对小鼠NK细胞活性无影响。

表8 小鼠NK细胞活性试验结果（±s，n=10）

注：NK细胞活性转换值X=Sin-1（p）1/2。

3 小结与讨论

采用迟发型变态反应试验、脾淋巴细胞转化试验、血清溶血素测定、脾淋巴细胞抗体生成试验、碳廓清试验、腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞试验、NK 细胞活性测定等，研究破壁灵芝孢子铁皮石斛粉的增强免疫力作用。结果表明，破壁灵芝孢子铁皮石斛粉可增强小鼠迟发型变态反应，提高血清溶血素半数溶血值及碳廓清吞噬指数。由此可判定，破壁灵芝孢子铁皮石斛粉可显著增强细胞免疫功能及单核-巨噬细胞吞噬功能，具有明确的增强免疫力作用。