一株野生长根菇的分类鉴定

2022-06-16唐丽娜李秀梅

食用菌 2022年3期

崔晓孔怡唐丽娜李秀梅

（泰安市农业科学院食用菌研究所，山东泰安271000）

卵孢长根菇Hymenopellis raphanipes俗称长根菇，属于真菌界Eumycetes、担子菌门Basidiomycota、伞菌纲Agaricomycetes、伞菌目Agaricales、膨瑚菌科Physalacriaceae，是珍稀的食药用真菌之一[1]。长根菇肉质细嫩，柄脆可口，营养丰富，富含氨基酸、维生素、微量元素等，所含的长根菇多糖[2]对治疗肿瘤、降低血压具有显著作用。由此可见，长根菇食用、药用价值较高，市场潜力大，开发前景广阔。笔者分离采自泰山山脉的一株野生长根菇，并进行形态学、rDNAITS序列分析鉴定，旨在为长根菇育种提供种质资源。

1 材料与方法

1.1 供试材料

一株野生长根菇子实体采自泰山山脉（东经117.0405°，北纬36.1614°，海拔577 m），经组织分离获得纯培养物，保存于泰安市农业科学院食用菌研究所，编号为chang-202001。

1.2 培养基配方

PDA 培养基：马铃薯（去皮）200 g，葡萄糖20 g，KH2PO43 g，MgSO41.5 g，琼脂20 g，加水定容至1 L。121 ℃灭菌30 min，然后倒平板，每平板定量为20 mL。

1.3 试验主要试剂及仪器

主要试剂：真菌总DNA 提取试剂盒（E.Z.N.A.®Fungal DNA Kit）、2×EasyTaq PCR SuperMix（北京全式金生物技术有限公司），常规试剂为进口分装或国产分析纯试剂。

主要仪器：LDZX-75KBS 立式高压蒸汽灭菌锅（上海申安医疗器械厂），SPX-250BS-II 恒温培养箱、制冷恒温摇床、电泳仪、高速离心机、凝胶成像系统（上海新苗医疗器械制造有限公司）。

1.4 试验方法

1.4.1 菌株纯化

采用组织分离法[3]得到野生子实体的PDA 纯培养物，待菌丝萌发后，3 次纯化培养获得菌丝纯培养，编号为chang-202001。

1.4.2 形态学鉴定

形态学鉴定方法采用宏观形态特征、显微结构[1]相结合的方法。挑取菌块于PDA 平板上进行活化，定期观察菌落特征；用插片法[4]观察菌丝的显微结构。参照《中国大型真菌》[5]对chang-202001 进行形态学鉴定，观察孢子印、子实体及附属物等外观特征，以及是否有特殊气味；显微观察菌丝、孢子等特征。

1.4.3 分子生物学鉴定

1.4.3.1 ITS序列扩增与测序

采用真菌总DNA 提取试剂盒提取DNA 后，使用真菌ITS 通用引物（ITS1/ITS4）进行PCR 扩增。引物序列为ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）、ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）。PCR 反应体系50 μL：模板1 μL（约20 ng），2×PCR Taq Master Mix25 μL，0.4 nmol/L 正向引物和反向引物各1 μL，ddH2O 补足至50 μL。PCR 扩增反应程序：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，共35 个循环；最后72 ℃补平7 min，4 ℃终止反应。

图3 菌落形态

PCR 扩增产物进行DNA 纯化、测序，由山东省农业科学院生物技术研究中心完成。1.4.3.2 系统发育树的构建

将测得的ITS 序列用DNAMAN 进行拼接，将拼接后的ITS 序列提交到GenBank 数据库，BLAST 检索获得多条同源性较高的rDNA ITS 参考序列（表1），采用MEGA7.0构建系统发育树。

表1 系统发育分析所用的rDNA ITS参考序列

2 结果与分析

2.1 形态学鉴定

野生长根菇子实体中等至稍大，菌盖3.2~6.5 cm，半球形至渐平展，中部凸起或似脐状，浅褐色至黑褐色。菌肉白色，薄。菌褶白色，较宽，不等长（图1）。菌柄近菌盖处颜色较深，浅褐色至褐色。孢子印白色，孢子无色，光滑，椭圆形或卵圆形。平板培养的菌落白色，边缘整齐，气生菌丝明显；光学显微镜下观察菌丝体形态，显示菌丝有隔、无色透明，有分枝，具有锁状联合。（图2-图4）条相似序列作为参考序列，以鸡菌Termitomyces

图1 野生长根菇子实体形态

图4 菌株显微形态（40×10）

2.2 分子鉴定

对菌株chang-202001 的rDNA ITS 序列进行PCR 扩增和测序，获得长度为625 bp 的DNA 片段，将获得的ITS 序列上传至NCBI 获得序列号（MT974249）并进行BLAST 比对，发现其与Hymeno⁃pellis raphanipes中HKAS95783[1]的rDNA ITS 最为接近，相似度100%。从NCBI 数据库内下载已知的多clypeatus（KM657823）[6]为外群，运用MEGA7.0 软件Neighbor-Joining 法构建系统发育进化树（图5），并运行1000 次以bootstrap 检验系统发育树的可靠性。由图5 可知，菌株chang-202001 同3 个卵孢长根菇分离物（KX688238、KX688236、KX688232）聚为一簇，与中国台湾地区的Hymenopellis raphanipesLC512057的亲缘关系较远，与其他来自不同国家和地区的同属菌株的ITS 核苷酸一致率为94.98%~100.00%。