猴头菌菌丝体发酵条件优化研究

2022-06-16鞠正福周巨川董国秀

食用菌 2022年3期

鞠正福周巨川董国秀

（1 青岛市城阳区上马街道办事处农业农村服务中心，山东青岛266112；2 青岛蓝佳生物科技有限公司，山东青岛266112）

猴头菌Hericium erinaceus，别名猴头蘑、羊毛菌、猴头菇，属真菌界，担子菌门，伞菌纲，多孔菌目，齿菌科，猴头菌属。猴头菌是一种腐生菌，子实体为团块状、质地柔软，子实体的中部和中下部为圆柱状菌针，全形似刺猬或猴头，子实体初期为白色，干后呈浅褐色，孢子呈球形，光滑无色[1-2]。

猴头菌是一种药食两用菌，含多糖类及氨基酸，并含多肽类及草菌酸[3]。研究表明，猴头菌不仅对消化系统疾病有特殊疗效，而且还具有增强免疫力、抗肿瘤、抗衰老、降血糖、保护神经和抗菌作用[4]。

猴头菌人工栽培技术已较为成熟，但生产周期长、产量低且不稳定。发酵培养猴头菌菌丝体，成本低，周期短，产量高。目前关于猴头菌深层发酵有关研究报道的结论还不完全一致[5-9]，刘艳芳等[5]研究得出最优培养基主要为葡萄糖3%，可溶性淀粉2%，酵母膏1%；刘灵霞[6]研究得出液体培养猴头菌的最佳碳源是葡萄糖，最佳氮源为蛋白胨；刘晓鹏等[8]报道可溶性淀粉和黄豆粉分别为最佳的碳源和氮源；信文娟等[9]筛选出葡萄糖3%，山药粉0.4%，花生粉1%，玉米浆干粉0.6%为猴头菌发酵培养的最优培养基。由此可见，不同研究者得出的猴头菌液体培养基配方存在很大差异。

试验以猴头菌菌丝体干重为评价指标，对猴头菌液体培养基进行优化，提高其菌丝体产量，为猴头菌相关产品开发提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

（1）菌株：猴头菌菌株CGMCC5.783，购自中国普通微生物菌种保藏管理中心。

（2）培养基：斜面培养基采用PDA 培养基，取去皮马铃薯200 g，切成小块，加水1 000 mL 煮沸30 min，滤去马铃薯块，加葡萄糖20 g，琼脂20 g，加蒸馏水将滤液补足至1 000 mL，pH自然，115 ℃灭菌30 min。

液体种子培养基：葡萄糖2%，蛋白胨1%，Mg‐SO4·7H2O 0.1%，KH2PO40.15%，pH 自然，250 mL 三角瓶装液量100 mL，115 ℃灭菌30 min。

（3）主要仪器设备：JL2004B 分析天平（上海佑科仪器仪表有限公司）、TMHS-50 恒温恒湿培养箱（常州托曼仪器制造有限公司）、YXQ-LS-50S 型立式压力蒸汽灭菌器（上海博讯实业有限公司医疗设备厂）、ZW-QH23 组合式振荡培养箱（常州金坛中旺仪器制造有限公司）、YT-700 型电热恒温鼓风干燥箱（绍兴沪越仪器设备有限公司）。

1.2 培养方法

1.2.1 猴头菌斜面的制备

将0.5 cm2的猴头菌菌丝块接种于PDA 斜面培养基中，置于26 ℃培养箱中培养10 d，备用。

1.2.2 液体种子培养

在无菌条件下，将4 块0.5 cm2的斜面猴头菌菌丝接入装有100 mL液体种子培养基的摇瓶中，置于转速为150 r/min 的摇床上26 ℃振荡培养7 d，再次接入液体种子培养基中，相同条件下培养7 d，备用。

1.2.3 发酵培养

将约7 d菌龄的菌种接入装有100 mL 发酵培养基的摇瓶中（250 mL 三角瓶装液量100 mL）接种量为10%，置于26 ℃，转速为150 r/min 摇床上振荡培养10 d。

1.2.4 碳源筛选试验

碳源主要考察对象为迟效碳源，为满足菌丝体初期生长的养分需求，故添加葡萄糖10 g/L，另外添加蛋白胨5 g/L，MgSO4·7H2O1 g/L，KH2PO41.5 g/L，VB10.01 g/L，在此基础上分别添加可溶性淀粉、玉米粉（煮沸30 min，4 层纱布过滤取滤液，以下玉米粉处理相同）、甘蔗糖蜜、蔗糖、红糖和甘油，添加量均为30 g/L，pH 5.5，在115 ℃条件下灭菌30 min。每个碳源处理3个重复。

1.2.5 氮源筛选试验

葡萄糖 30 g/L，MgSO4·7H2O 1 g/L、KH2PO41.5 g/L、VB10.01 g/L，在此基础上分别添加酵母粉、黄豆粉（煮沸30 min，4 层纱布过滤取滤液，以下黄豆粉处理相同）、豆粕粉、蛋白胨、牛肉粉，添加量均为10 g/L，pH 5.5，在115 ℃条件下灭菌30 min。每个氮源处理3个重复。

1.2.6 碳氮源正交试验

选取碳源葡萄糖和玉米粉，氮源酵母粉和黄豆粉为因素进行正交优化试验，正交表选用L9（34），正交设计见表1。每个处理3个重复。

表1 碳氮源正交因素和水平单位：g/L

1.3 菌丝体测定方法

用50 μm滤膜抽滤收集菌丝体，称湿重并记录，于60 ℃烘箱中干燥28 h至恒重，记录菌丝体干重。

2 结果与分析

2.1 供试碳源对猴头菌菌丝体生物量的影响

由图1 可知，以玉米粉为碳源的培养基获得的猴头菌菌丝体生物量（菌丝干重，下同）最高（1.39%），以甘油为碳源的培养基培养的菌丝体生物量最低。由此可知，猴头菌对玉米粉的利用率最高，对甘油的利用率最低。葡萄糖是速效碳源，能够在菌丝体生长初期快速提供碳源，玉米粉作为迟效碳源，在菌丝体生长后期有明显的促进菌丝生长作用，所以最佳碳源选择玉米粉和葡萄糖复配进行正交试验。

图1 供试碳源对猴头菌菌丝体生物量的影响

2.2 供试氮源对猴头菌菌丝体生物量的影响

以往研究表明，无机氮源不宜用于真菌培养[9]，故试验全部用有机氮源。

由图2 可知，以黄豆粉为氮源的培养基获得的猴头菌菌丝体生物量最高（1.41%），酵母粉其次，以蛋白胨为氮源的培养基获得的菌丝体生物量最低。故选择黄豆粉和酵母粉复配进行正交试验。

图2 供试氮源对猴头菌菌丝体生物量的影响

2.3 复合碳氮源的正交试验结果

图3 菌丝体发酵培养前期（左为第一次培养液体种子，右为转接后液体种子）

图4 菌丝体发酵培养后期（培养第9天）

图5 过滤后菌丝体（验证试验）

由表2 可知，组合5 的猴头菌菌丝体干重最高，所对应培养基为玉米粉30 g/L，葡萄糖10 g/L，酵母粉12.5 g/L，黄豆粉5 g/L。从K值分析看出各因素最大K值对应的试验组合为A2B2C2D1，所对应的因素水平为玉米粉30 g/L，葡萄糖10 g/L，酵母粉10 g/L，黄豆粉5 g/L。从R值看出RA＞RB＞RD＞RC，即四因素影响力大小比较为玉米粉＞葡萄糖＞黄豆粉＞酵母粉。