抗帕颗粒与益生菌对帕金森便秘小鼠α-Syn在脑肠轴不同部位表达的影响

邱 伟，王永兵，赵晓晖，王云峰，徐 斌，杨 娟，刘慧琴，徐白莹

(上海市浦东新区人民医院，上海 201200)

帕金森病是一种常见的进行性神经系统退行性疾病，便秘是帕金森病的一个危险因素，并且贯穿整个病程[1]。α-突触核蛋白(α-Syn)是帕金森病的病理标志物，其经交感神经和副交感神经转运至中枢神经系统沉积，通过脑-肠-微生物轴双向相互作用[2]，干预肠道α-Syn的传递有望成为帕金森病的治疗新途径。相关研究显示，中药可以改善帕金森病的运动症状和非运动症状，且不良反应要小于常用的西药[3]。本实验观察了抗帕颗粒与酪酸梭菌活菌对帕金森病小鼠模型肠壁、迷走神经、大脑黑质组织中α-Syn及黑质纹状体中酪氨酸羟化酶(TH)表达的影响，探讨其作用机制，现将结果报道如下。

1 实验材料与方法

1.1实验动物 SPF级健康C57BL/6雄性6周龄小鼠50只，体重20～22 g，由上海灵畅生物科技公司供应，动物许可证号：SCXK(沪)2018-0003。实验于复旦大学药学院进行；饲养环境温度20～24 ℃，相对湿度40%～70%，工作照度150～300 Ix，动物照度15～20 Ix，12 h昼夜节律喂养。小鼠自进入动物房起，每周称重1次，直到整个实验结束。

1.2主要试剂 1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶(MPTP)购自美国Sigma公司，抗帕颗粒(由熟地、山萸肉、红参、生黄芪、丹参、水蛭、全蝎、僵蚕组成)由南通大学医学院第二附属医院提供[通制剂(2001)02-050]，酪酸梭菌活菌购自上海信谊药厂有限公司，兔抗大鼠TH单克隆抗体、罗达明标记羊抗兔Ⅱ抗、FITC 标记羊抗小鼠Ⅱ抗购于美国CST公司，小鼠抗大鼠α-Syn 单克隆抗体购自英国abcam 公司，HRP标记的羊抗兔Ⅱ抗及HRP标记的羊抗小鼠Ⅱ抗购自proteintech公司。

1.3实验方法 在小鼠8周龄时，随机分为空白组、模型组、酪酸梭菌活菌组、抗帕颗粒组、酪酸梭菌活菌+抗帕颗粒组，每组10只放在一笼，统一在小鼠右耳订耳标，整个饲养期间饮食饮水不限。在9周龄1 d时，模型组、酪酸梭菌活菌组、抗帕颗粒组、酪酸梭菌活菌+抗帕颗粒组给予MPTP配制溶液40 mg/(kg·d)腹腔注射，连续7 d；空白组给予同体积生理盐水腹腔注射，连续7 d。建模后第8天开始，酪酸梭菌活菌组给予酪酸梭菌活菌109个/d灌胃，抗帕颗粒组给予抗帕颗粒40 mg/(kg·d)灌胃，酪酸梭菌活菌+抗帕颗粒组给予酪酸梭菌活菌109个/d和抗帕颗粒组40 mg/(kg·d)灌胃，模型组和空白组给予0.9%氯化钠溶液1 mL/d灌胃，均1次/d,连续4个月。

1.4实验取材 灌胃4个月结束后每组中随机取一半小鼠做脑组织冷冻切片：采用氯胺酮(100 mg/kg)+赛拉嗪(10 mg/kg)进行深度麻醉，打开胸腔经心脏依次灌注生理盐水20 mL和多聚甲醛30 mL。灌注完毕后将小鼠断头取脑，置于4%多聚甲醛中4 ℃条件下固定24 h。依次浸入15%，20%，30%蔗糖溶液中4 ℃过夜后，入包埋剂OCT中冰冻包埋。将脑组织切25 μm厚切片，隔5片取1片，入PBS(0.01 mol/L)中-4 ℃保存。每组剩余一半小鼠用3%水合氯醛按照0.01 mL/g剂量腹腔注射麻醉，打开腹腔，在手术显微镜下于食管腹段的前、后壁找出并分离切断，获取0.3～0.5 cm迷走神经前、后干；显露后切取中段结肠约3 cm并多聚甲醛固定24 h，另取约3 cm结肠标本投入液氮，于-80 ℃保存以备检测。

1.5检测指标及方法

1.5.1结肠、迷走神经、黑质组织中α-Syn蛋白表达检测 采用免疫印迹(Western blot)法检测：取上述结肠、迷走神经、黑质组织各0.01 g，剪碎后放入匀浆器内，加入预冷的RIPA裂解液混匀，冰上组织裂解30 min后15 000 r/min离心10 min，取上清行蛋白质定量测定。在酶标板中加入2.5 μL待测蛋白和17.5 μL PBS，加入200 μL BCA工作液振荡30 s，37 ℃放置30 min，在562 nm下测定吸光度，根据标准曲线上查得相应的蛋白浓度，根据样品浓度确定上样量。蛋白浓度=(样本OD值的平均值-对照OD值平均值)×斜率。按体积比1∶4加SDS-PAGE蛋白上样缓冲液，封闭3 h，4 ℃孵育小鼠抗大鼠α-Syn 单克隆抗体(1∶500)过夜，室温下分别孵育HRP 标记的羊抗兔Ⅱ抗(1∶1 000)及HRP标记的羊抗小鼠Ⅱ抗(1∶1 000)1 h，剥脱液洗膜后以小鼠抗大鼠β-actin 单克隆抗体(1∶500)孵育4 ℃过夜，并以HRP 标记的羊抗小鼠Ⅱ抗(1∶1 000)室温下孵育1 h；一体式化学发光仪拍摄照片，Image J软件分析条带吸光度。

1.5.2黑质组织中TH、α-Syn 免疫荧光双染检测石蜡切片脱蜡回水后微波热修复抗原，5% BSA 封闭1 h，同时加入兔抗大鼠TH 单克隆抗体(1∶2 00)及小鼠抗大鼠α-Syn单克隆抗体(1∶200)，并于4 ℃孵育过夜，罗达明标记羊抗兔Ⅱ抗(1∶100)及FITC标记羊抗小鼠Ⅱ抗(1∶100)，室温孵育2 h后于荧光显微镜下观察、拍照。TH呈现红色荧光；α-Syn呈现绿色荧光。每组重复3次，每张切片取3个随机视野，计算并统计平均荧光强度。

1.6统计学方法 采用SPSS 21.0软件进行数据统计分析，使用GraphPad Prism8软件制图。数据符合正态分布且方差齐性，多组间比较使用单因素方差分析，方差非齐性则采用事后比较Dunnett检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1各组小鼠结肠壁、迷走神经、黑质组织中α-Syn表达情况 模型组结肠、迷走神经、黑质组织中α-Syn蛋白表达量均明显高于空白组(P均<0.05)；益生菌组、抗帕颗粒组、益生菌+抗帕颗粒组结肠、迷走神经、黑质组织中α-Syn蛋白表达量均明显低于模型组(P均<0.05)，抗帕颗粒组和益生菌+抗帕颗粒组结肠、迷走神经、黑质组织中α-Syn蛋白表达量均明显低于益生菌组(P均<0.05)，且益生菌+抗帕颗粒组结肠、黑质组织中α-Syn蛋白表达量均明显低于抗帕颗粒组(P均<0.05)；益生菌+抗帕颗粒组迷走神经、黑质组织中α-Syn蛋白表达量与空白组比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。见图1及图2。

图1 空白组和帕金森便秘各组小鼠结肠、迷走神经、黑质组织中α-Syn相对表达量

图2 空白组和帕金森便秘各组小鼠结肠、迷走神经、黒质组织中α-Syn表达条带

2.2各组小鼠黒质组织中TH和α-Syn免疫荧光染色情况 镜下观察，模型组TH染色数量明显少于空白组(P<0.05)，益生菌组、抗帕颗粒组、益生菌+抗帕颗粒组均明显多于模型组(P均<0.05)；模型组α-Syn染色数量明显多于空白组(P<0.05)，益生菌组、抗帕颗粒组、益生菌+抗帕颗粒组均明显少于模型组(P均<0.05)。见图3及图4。

图3 空白组和帕金森便秘各组小鼠黒质组织中TH和α-Syn免疫荧光染色(×200)

图4 空白组和帕金森便秘各组小鼠黒质组织中TH和α-Syn免疫荧光染色数量比较

3 讨 论

帕金森病主要的病理改变是脑组织内α-Syn异常累积伴有黑质多巴胺能神经元变性坏死，黑质残存神经元胞质内出现路易小体，从而引起运动症状和非运动症状[3-4]。2003年Braak提出了著名的肠道起源学说[5]，并逐渐被各种研究所证实。Harsanyiova等[6]的一项荟萃分析表明，便秘的发生可先于帕金森病诊断10年以上。Beck等[7]认为肠神经丛中出现路易小体，可以解释帕金森病患者胃肠道动力的减退。本实验结果显示，模型组TH染色数量明显少于空白组，α-Syn染色数量明显多于空白组，与课题组前期的实验结果相一致[8]；模型组结肠、迷走神经和大脑黑质组织中α-Syn蛋白表达量均明显高于空白组，提示α-Syn异常聚集作为帕金森病重要的病理改变同样存在于肠壁组织、迷走神经，也进一步证实了肠道起源学说。

肠道菌群在帕金森病及其便秘的发生、发展中起重要作用，肠道菌群的变化可诱发炎症反应，从而触发α-Syn的错误折叠[9],引起肠神经内α-Syn的分泌，进而通过迷走神经以类似朊蛋白在神经系统传递的方式进入中枢神经系统；另外，肠道菌群还可能通过调节短链脂肪酸(SCFA)依赖的基因表达,使α-Syn清除相关机制受损，引起α-Syn在肠神经系统及中枢神经系统的沉积[10]。推测改善肠道菌群失衡可抑制帕金森病发生发展。Sampath等[11]研究证实益生菌可抑制帕金森病动物模型胃肠运动损伤，改善胃肠动力。故本研究将益生菌作为干预对照，结果显示干预4个月后益生菌组结肠、迷走神经、黑质组织中α-Syn蛋白表达量均明显低于模型组,尤其是结肠组织中表达量更低；大脑黑质α-Syn、TH免疫荧光双染显示，TH表达明显多于模型组，α-Syn表达明显少于模型组。说明益生菌干预可在一定程度上减少或延缓α-Syn在脑肠轴的传递，保护黑质多巴胺神经元，继而改善帕金森病相关症状，有望成为帕金森病临床实践中的治疗选择。

中医认为帕金森病属“颤证”，病位在肝肾，病机是肝肾不足，治疗原则以补肾养肝为主[12]。《灵枢·动输》记载：“胃气上注于肺……上走空窍，循眼系，入络脑。”认为胃肠与脑在经脉循行上密切相关。倪光夏等[13]结合中医理论和现代脑肠微生物轴理论，提出“脑神失职”是帕金森病的病因病机。苗继文等[14]认为脾胃气机升降失调、大肠传导失职与肠道菌群失调互为因果。因此，调节大脑功能，可通过“脑肠轴”下行途径影响胃肠功能，恢复肠道菌群稳态；调节胃肠功能，增加肠道有益菌群，可通过“脑肠轴”上行途径调节脑功能[15]。抗帕颗粒是本课题组早期研制的中药组方，临床应用显示能延缓帕金森病进展，改善帕金森病的运动和非运动症状[16-17]。

本实验结果显示，抗帕颗粒组、益生菌+抗帕颗粒组结肠中α-Syn蛋白表达量均明显低于模型组，且益生菌+抗帕颗粒组最低，说明在改善肠道菌群失调、阻止α-Syn突破肠黏膜沉积于肠壁方面，益生菌和抗帕颗粒有明显的协同作用。在迷走神经组织中，抗帕颗粒组、益生菌+抗帕颗粒组α-Syn蛋白表达量均明显低于模型组，与空白组相似，说明在迷走神经α-Syn逆传递中，抗帕颗粒及与益生菌联合应用具有更好的阻滞上传作用。在黑质层面，抗帕颗粒组、益生菌+抗帕颗粒组α-Syn蛋白表达量均明显低于模型组，且TH染色数量增加，α-Syn染色数量减少，说明抗帕颗粒单用及与益生菌联合应用均可显著抑制α-Syn在黑质的沉积，均可延缓帕金森病进程，但二者联合应用抑制α-Syn在黑质沉积的作用更显著。

综上所述，MPTP制作的帕金森病便秘模型小鼠的肠壁、迷走神经及大脑黑质中α-Syn的表达增加，而抗帕颗粒和益生菌干预可阻止α-Syn突破肠黏膜沉积于肠壁神经，延缓α-Syn迷走神经逆传递和黑质纹状体沉积，且二者对减缓α-Syn沿脑肠微生物轴的传递有协同效应，相关作用机制还有待进一步研究。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突。