纳豆芽孢杆菌发酵海参条件的响应面优化

白云洲，赵前程，2，3，吕 东，秦 娟，程潆辉，李 萌，2，4，李 莹，2，3

（1. 大连海洋大学食品科学与工程学院，辽宁大连 116023；2. 辽宁省水产品分析检验及加工技术科技服务中心，辽宁 大连 116023；3. 海洋食品精深加工关键技术省部共建协同创新中心，辽宁大连 116023；4. 辽宁省水产品加工及综合利用重点实验室，辽宁大连 116023）

海参的保健功能一直备受关注，特别是几次大规模疫情爆发之后更是得到广泛认可，正逐渐从传统食材向健康机能性食品过渡[1]。海参产品主要以盐渍和干制等传统加工品为主，近年来针对消费者需求的简便化加工品即食产品相继面世[2-3]。在海参精深加工技术上，主要以酶解海参肽为主，海参胶囊、海参酒和海参液等保健功效产品已相继走向市场[4-5]。

目前，海参的精深加工产品仍然匮乏，不能满足市场多元化的需求，发酵海参产品仍处于空白阶段。益生菌是通过摄入一定的量，对食用者的健康发挥有效作用的活性微生物，对维持肠道微生态稳定、抑制病原微生物侵袭、调节免疫防御等方面有着重要作用[6]。纳豆芽孢杆菌作为一种益生菌，属于枯草芽孢杆菌的一个亚种，其蛋白酶活性较高，利用纳豆芽孢杆菌进行发酵能够有效降解大分子蛋白质，改善食品的营养价值，增强保健功效[7-8]。

将益生菌应用到海参加工中，利用益生菌产生的蛋白酶分解大分子蛋白质，开发绿色环保海参提取技术，不仅能够填补市场空白，带来巨大经济效益，同时还能对保健品行业的发展和人类的健康起到积极推动作用。但是，利用益生菌发酵海参的过程伴随着复杂的物质转化，发酵前后海参功能成分如何变化，直接影响发酵这种加工方式在海参精深加工中的应用[9]。以蛋白酶活性为指标，在单因素试验的基础上，采用响应面法对纳豆菌发酵海参的各个工艺条件进行优化，为新型海参精深加工产品的开发与应用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

海参，大连财神岛集团有限公司提供；纳豆芽孢杆菌实验室分离保藏，福林酚试剂、酪氨酸、酪蛋白，北京索莱宝科技有限公司提供；无水葡萄糖、三氯乙酸、无水碳酸钠、乙酸、磷酸氢二钠、盐酸、氢氧化钠，天津市大茂化学试剂厂提供；LB 肉汤培养基，青岛海博生物技术有限公司提供。

千分之一精密电子天平，济宁市裕泽工业科技有限公司产品；高压蒸汽灭菌锅，山东创美机械科技有限公司产品；FC3 酶标仪，赛默飞世尔科技公司产品；恒温培养摇床，上海川一实验仪器有限公司产品。

1.2 试验方法

1.2.1 蛋白酶活性的测定

参照吴博华等人[10]的方法，并稍加改动，绘制酪氨酸标准曲线：

式中：

Y——吸光度；

X——酪氨酸质量浓度，mg/mL。

样品的测定：1 mL 适当稀释的发酵液样品，加入酪蛋白底物缓冲液1 mL，迅速混匀后放入40 ℃水浴反应10 min，取出后立即加入TCA 溶液2 mL，继续水浴20 min。过滤剩余酪蛋白沉淀物，取1 mL滤液，加入碳酸钠溶液5 mL 和福林酚试剂1 mL，于波长660 nm 处测定吸光度，蛋白酶活性计算公式如下：

式中：

A——酪氨酸释放量，mg/mL；

V——反应液总体积，mL；

N——酶液的稀释倍数；

t——反应时间，min。

1.2.2 单因素试验

研究海参添加量（10%，20%，30%，40%，50%）、接种量（1%，2%，3%，4%，5%）、葡萄糖添加量（5%，10%，15%，20%，25%）、pH 值（4，5，6，7，8）、温度（30，35，40，45 ℃） 和转速（100，120，140，160，180 r/min） 等6 个因素对蛋白酶活性的影响，在研究单因素影响时，选取其余因素中间值为发酵条件，考查各因素对蛋白酶活性的影响。

1.2.3 响应面试验

（1） PB 试验设计[11]。根据单因素试验结果，利用Design Expert 软件，将海参添加量、葡萄糖添加量、接种量、pH 值、转速和温度6 个因素，以蛋白质酶活力为响应值，进行PB 试验设计试验，每个因素设置高（+1） 和低（-1） 2 个水平。

海参纳豆菌发酵各因素与水平设计见表1。

表1 海参纳豆菌发酵各因素与水平设计

（2） CCD 试验设计[11]。根据PB 试验结果，利用Design Expert 软件，以蛋白质酶活力为响应值，将对蛋白酶活性具有显著影响的3 个因素（海参添加量、葡萄糖添加量和接种量） 进行CCD 试验。

表2 CCD 试验各因素与水平设计

1.3 数据处理

所有试验均设置3 次平行，数据处理采用Excel 2010 进行统计学分析，响应面采用Design ExpertV 8.0.6.1 软件进行设计和方差分析，p＜0.05 为显著。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 海参添加量对蛋白酶活性的影响

海参添加量对蛋白酶活性的影响见图1。

由图1 可知，海参添加量为10%～20%时，蛋白酶活性随着海参添加量的增加急剧增加，在海参添加量为40%时，蛋白酶活性达到最大，随着海参添加量的继续增加，蛋白酶活性开始下降。营养物质的组成和浓度对微生物的生长有着显著的影响，只有在合适的范围内，微生物才能正常生长，过高或过低都不利于微生物的生长[12]。因此，选取海参添加量20%～50%进行后续响应面试验。

图1 海参添加量对蛋白酶活性的影响

2.1.2 接种量对蛋白酶活性的影响接种量对蛋白酶活性的影响见图2。

图2 接种量对蛋白酶活性的影响

由图2 可知，随着接种量的增加，蛋白酶活性呈现先升高后降低的趋势。接种量过低时，菌株的延滞期过长，不利于菌株的生长和产酶。接种量为2%时，蛋白酶的活性最高，但接种量为2%～5%时，蛋白酶活力无显著性差异。因此，选取接种量2%～5%进行后续响应面试验。

2.1.3 葡萄糖添加量对蛋白酶活性的影响

葡萄糖添加量对蛋白酶活性的影响见图3。

图3 葡萄糖添加量对蛋白酶活性的影响

由图3 可知，随着葡萄糖添加量的增加，蛋白酶活性逐渐降低。葡萄糖添加量为5%时，蛋白酶活性最高，但葡萄糖添加量为5%～10%时，蛋白酶活力无显著性差异。葡萄糖浓度过高时，会导致渗透压过高从而抑制菌株生长。因此，选取葡萄糖添加量5%～10%进行后续响应面试验。

王京元等[8]在王茜等研究的基础上利用车道功能矩阵和相位矩阵，给出相对完整的信号交叉口车道功能划分的计算步骤. 但是只进行简单的理论计算，缺乏实证研究. 刘培华等[9]提出通过3阶段：信号配时方案对比—确定渠化形式—信号配时优化，结合Synchro等仿真软件针对信号交叉口信号配时现状方案进行研究，给出优化方案，文章针对北京某交叉口给出优化过程，但是缺乏普适性.

2.1.4 pH 值对蛋白酶活性的影响

pH 值对蛋白酶活性的影响见图4。

图4 pH 值对蛋白酶活性的影响

由图4 可知，随着pH 值的增加，蛋白酶的活性呈现先升高后降低的趋势，pH 值为7 时，蛋白酶活力最高，但pH 值为5～7 时，蛋白酶活力无显著性差异。pH 值对菌株细胞膜的透过性和营养成分的可溶性均具有影响，从而影响菌株对营养成分的吸收和生长产生影响，与胡亚平等人[13]的结果相似，pH 值过高或过低都不利于纳豆菌的生长。因此，选取pH值5～7 进行后续响应面试验。

2.1.5 发酵温度对蛋白酶活性的影响

发酵温度对蛋白酶活性的影响见图5。

图5 发酵温度对蛋白酶活性的影响

由图5 可知，随着发酵温度的升高，蛋白酶活性逐渐降低。发酵温度为30 ℃时，蛋白酶活力最高，但发酵温度为30～40 ℃时，蛋白酶活力无显著性差异。有研究表明，纳豆菌蛋白酶的最适发酵温度为37 ℃，高于40 ℃蛋白酶的稳定性降低[14]。因此，选取发酵温度30～40 ℃进行后续响应面试验。

2.1.6 转速对蛋白酶活性的影响

转速对蛋白酶活性的影响见图6。

由图6 可知，随着转速的增加，蛋白酶活性呈现先升高后降低的趋势。转速为120 r/min 时，蛋白酶活力最高，但转速为120～180 r/min时，蛋白酶活力无显著性差异。转速影响发酵液中的溶解氧含量，纳豆菌为好氧型微生物，转速过低不利于菌株生长。王婷[15]采用纳豆菌发酵海参卵，转速为180 r/min时，蛋白酶活性最高可达6 723 U/mL。因此，选取转速120～180 r/min 进行后续响应面试验。

图6 转速对蛋白酶活性的影响

2.2 PB 试验分析

根据单因素试验的结果，选择海参添加量、葡萄糖添加量、温度、pH 值、接种量和转速6 个因素，以蛋白酶活性作为响应值，采用PB 试验优化纳豆菌发酵海参的工艺条件。

PB 试验设计及蛋白酶活性响应值见表3，PB 试验中各因素、水平及影响力见表4。

表3 PB 试验设计及蛋白酶活性响应值

表4 PB试验中各因素、水平及影响力

试验设计了5 个虚拟因素以满足计算试验误差的需求，试验次数为12 次，每个因素设置高、低2 个水平，考查影响蛋白酶活性的主要影响因素。表3为PB 试验的设计及蛋白酶活性响应值，根据表3 中的设计进行发酵，测定了不同发酵条件下蛋白酶的活性。使用Design Expert 软件进行分析，可以获得发酵条件对蛋白酶活性的影响及其显著性。各变量对蛋白酶活性影响显著程度依次为X3＞X1＞X2＞X6＞X4＞X5，设定置信度大于95%（p＜0.05） 为具有显著影响，则海参添加量、葡萄糖添加量和接种量对蛋白酶活性有显著性影响。

2.3 CCD 试验分析

通过CCD 试验对PB 试验得到的3 个主要因素进行进一步优化，以获得每个因素的最佳条件。

CCD 试验设计及蛋白酶活性响应值见表5。

表5 CCD 试验设计及蛋白酶活性响应值

利用Design Expert 软件进行分析可得到蛋白酶活性与培养条件间的关系方程如下：

式中：Y——蛋白酶活性，U/mL。

CCD 试验模型的显著性分析见表6。

由表6 可知，试验模型的p＜0.05，说明该模型显著，可信度较高。3 个变量中海参添加量（X1），葡萄糖添加量（X2），接种量（X3） 对蛋白酶活性影响显著，与PB 试验的结果吻合。

表6 CCD 试验模型的显著性分析

通过响应面优化的方法，得到了上述的关系方程，从而可以求解该方程的极值，也就是蛋白酶活性最高值，同时求得对应的因素值。通过对该方程求一阶偏导，并令其等于零，即可求得X1，X2，X3分别为35%，7.5%和4%时，得到蛋白酶活性的最大理论值为522.56 U/mL。

2.4 响应面交互作用分析

各因素交互作用对蛋白酶活性影响的响应面见图7。

由图7 可知，三维图中的等高线椭圆程度代表两因素间交互作用对蛋白酶活性影响的显著性，由图7 可知，3 个因素之间的交互作用对蛋白酶活性影响都不显著，结果与显著性分析一致。但是，这3个拟合曲面的开口朝下，方程均有极大值，说明最优值是在所设定的范围内的，也进一步说明了最初取值范围的正确性。

图7 各因素交互作用对蛋白酶活性影响的响应面

2.5 模型验证

CCD 试验中预测的最佳发酵条件为海参添加量、葡萄糖添加量和接种量分别为35%，7.5%和4.0%时，蛋白酶活性的最大理论值为522.56 U/mL。根据预测出的最佳条件进行验证试验，得到蛋白酶活性的实际值为535.12 U/mL，与预测值522.56 U/mL 无显著差异（p＞0.05），证明该模型具有可靠性。

3 结论

以蛋白酶活性作为检测指标，在海参添加量、葡萄糖添加量、温度、pH 值、接种量、转速等单因素试验的基础上，采用响应面法对纳豆菌发酵海参的各个工艺条件进行优化，最佳工艺条件为海参添加量35%，葡萄糖添加量7.5%，接种量4%，在该条件下测得蛋白酶活性为535.12 U/mL，与理论值522.56 U/mL 相近。为新型海参精深加工产品的开发与应用提供科学依据。