异东莨菪内酯与东莨菪内酯吸收光谱和荧光光谱的比较研究

吕 芳, 李婷婷, 曹津津, 牛禄辰, 韩博聪, 魏雄飞, 李文红,*

(1. 河北工业职业技术大学 高等职业教育研究所, 河北 石家庄 050091; 2. 河北工业职业技术大学 环境与化学工程系, 河北 石家庄 050091)

香豆素类化合物是一类以苯并吡喃酮为母核的有机天然化合物, 在自然界中广泛存在, 是许多中药的活性成分。 异东莨菪内酯(Isoscopoletin)和东莨菪内酯(Scopoletin)为苯环取代的香豆素类化合物(见图1), 互为同分异构体。 异东莨菪内酯存在于杜鹃属(Rhododendron.L)、菊科植物灯盏花(Erigeron breviscapus(Vant.)Hand. Mazz)、刺异叶花椒(Z. dimorphophyllum var. spinifolium)等植物中, 东莨菪内酯存在于伞形科植物安兴白芷(Angelica dahurica)、菊科植物黄花蒿(Artemisia annual inn.)和茵陈蒿(Artemisia capillaries)、旋花科植物丁公藤(Erycibe obtusifolia Benth.)、华山参、枸杞子等植物中, 二者具有抗肿瘤[1-3]、预防高血压[4]、抗焦虑[5]、抗炎[6]、预防糖尿病[7]以及其他的药理作用[8-10]。 一般采用HPLC-UV[11-12]、LC-MS[13]、薄层色谱[14-15]、电极法[16]对异东莨菪内酯和东莨菪内酯的含量进行测定。 东莨菪内酯的荧光光谱和解离常数有相关文献报道[17-18], 异东莨菪内酯的紫外可见吸收光谱和荧光光谱未见相关报道。本文从分子结构出发，对比研究二者吸收光谱和荧光光谱的变化, 探寻分子结构与光谱变化的关系。 本文在研究过程中发现, 紫外吸收光谱中, 异东莨菪内酯和东莨菪内酯在碱性条件下的差异明显; 荧光光谱中, 东莨菪内酯在酸性、碱性条件下均可产生强荧光, 而异东莨菪内酯在酸性、碱性条件下产生的荧光相对较弱, 二者的荧光峰、荧光量子产率和在甲醇环境下的荧光峰也具有明显的差异性。 通过综合比较二者在各种实验条件下的吸收光谱和荧光光谱, 解释了异东莨菪内酯(6-OH)和东莨菪内酯(7-OH)在各种实验条件下可能的存在形态(分子型体、离子型体、水解产物)及其呈现不同光谱特征的分子结构原因。 本文研究结果为建立异东莨菪内酯和东莨菪内酯的分析方法奠定了基础, 也为研究其他香豆素类化合物的荧光性质提供了参考。

图1 异东莨菪内酯(a)和东莨菪内酯的分子结构(b)Fig.1 Molecular structures of isoscopoletin (a) and scopoletin (b)

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

F-7100荧光分光光度计( Hitachi ), 配备150 W氙灯, 1 cm荧光池, UV-30滤光片, 选择激发和发射狭缝( slit )为5.0 nm, 光电倍增管负高压(PMT )为700 V; UV-TU-1950紫外-可见分光光度计, 1 cm吸收池; Starter-3100型pH/ISE测试仪( Ohaus ); 十万分之一分析天平( Mettler toledo )。

异东莨菪内酯( isoscopoletin, 98.1%, PS2208-0020MG, 成都普思生物科技股份有限公司): 在100 mL 的容量瓶中, 准确称取0.010 30 g 异东莨菪内酯溶于100 mL甲醇中, 得到浓度103.0 mg/L的储备液, 用时用水或甲醇稀释。 东莨菪内酯( scopoletin, 98.1%, RUGS-2SB6, 中国食品药品检定研究院): 在100 mL 的容量瓶中,准确称取0.009 30 g 东莨菪内酯溶于100 mL甲醇中, 得到浓度93.0 mg/L的储备液, 用时用水和甲醇适当稀释。 Britton-Robinson缓冲溶液: 将磷酸、硼酸和乙酸混合溶液(浓度均为0.40 mol/L)与NaOH溶液(1.0 mol/L)以一定比例混合, 用于调节pH; 硫酸奎宁( 生化试剂, 麦克林 ): 以0.05 mol/L的硫酸溶液配制成1.00×10-5mol/L溶液; 甲醇( 色谱纯, TEDIA ), 所用酸碱试剂均为分析纯或优级纯, 实验用水为二次去离子水。

1.2 实验方法

对吸收光谱的影响 在一系列10 mL容量瓶中, 加入异东莨菪内酯或东莨菪内酯溶液, 以缓冲溶液调节不同的pH, 以水定容, 摇匀, 分别扫描溶液的吸收光谱。

对荧光光谱的影响 在一系列10 mL容量瓶中, 加入异东莨菪内酯或东莨菪内酯溶液, 以缓冲溶液调节不同的pH, 以水定容, 摇匀, 分别扫描溶液的荧光光谱。

溶剂对荧光光谱的影响 在一系列10 mL容量瓶中, 分别加入异东莨菪内酯或东莨菪内酯溶液和不同体积的甲醇, 以水定容, 摇匀, 分别扫描荧光光谱。

三维荧光图谱的绘制 在一系列10 mL容量瓶中, 加入异东莨菪内酯或东莨菪内酯溶液, 以缓冲溶液调节溶液的pH, 以水定容, 摇匀。 分别测定中性条件、碱性条件下的三维荧光图谱, 以水激发波长350 nm的荧光强度为对照绘制三维图。

荧光量子产率的测定 在25 mL容量瓶中加入适量硫酸奎宁溶液, 以0.05 mol/L H2SO4溶液定容, 摇匀; 扫描紫外吸收光谱和荧光光谱, 测量激发波长处的吸光度和积分荧光强度, 以硫酸奎宁在激发波长313 nm的荧光量子产率0.55 为参比, 计算异东莨菪内酯或东莨菪内酯待测物质的荧光量子产率[19]。

2 结果与讨论

2.1 pH对异东莨菪内酯水溶液吸收光谱的影响

考查了异东莨菪内酯水溶液在不同pH条件下的紫外-可见吸收光谱, 结果如图2在pH 2.22～6.24区间, 异东莨菪内酯溶液分别在波长295、345 nm附近出现吸收峰, 295 nm的吸收峰比较弱,345 nm的吸收较强 (见图2a) , 在酸性至中性条件下, 异东莨菪内酯紫外吸收光谱的峰型没有变化, 这一光谱对应于分子型体; 在pH 6.93～10.56区间, 随pH升高, 紫外光谱发生显著变化, 吸收峰分别在波长248、309、388 nm附近出现吸收峰, 248 nm处的吸收强度随着pH变大迅速增强, 为强吸收, 295 nm红移至309 nm, 吸收强度比较弱, 345 nm吸收强度快速降低, 逐渐红移至388 nm, 由于不同波长的吸光度值变化不同, 分别在235、286、300、317、368 nm波长处出现等色点 (见图2b) , 吸光度随着pH变化呈现离子电离时常见的S曲线 (见图2d) , 在中性至弱碱性条件下, 这一光谱变化对应于6位-OH质子的电离, 当pH为10.11～11.49时, 388 nm吸收峰的强度不再变化, 说明6位-OH质子全部电离; 当pH为11.49～12.50时, 波长248、388 nm的吸收强度迅速下降, 309 nm吸收峰蓝移至298 nm (见图2c) , 强碱条件下, 这一光谱变化对应于内酯水解开环, 详见图3。

根据图2(d)中的光谱数据, 可以用pH-分光光度法[20]计算异东莨菪内酯6-OH质子的电离常数 pKa= 9.14 ± 0.02。

2.2 pH对东莨菪内酯水溶液吸收光谱的影响

考察了东莨菪内酯水溶液在不同pH条件下的紫外-可见吸收光谱, 结果如图4。 在pH 2.25～6.05区间, 东莨菪内酯在波长295、340 nm附近出现吸收峰, 340 nm的吸收峰较强 (见图4a) 。 溶液从酸性至中性条件下, 吸收光谱的峰型几乎没有变化, 这一光谱对应东莨菪内酯分子型体的吸收峰; 在pH 6.51～10.53区间, 随pH升高, 295、340 nm波长的吸光度值逐渐降低, 340 nm波长逐渐红移至波长386 nm附近, 由于不同波长的吸光度值变化不同, 在235、280、354 nm波长附近出现等色点 (见图4b) , 这一光谱变化对应于7位-OH质子的电离, 随着pH升高, 386 nm吸收峰的强度逐渐增强。 当pH为9.94～10.53时, 386 nm吸收峰的强度不再变化, 说明7位-OH质子全部电离。 当pH > 10.70时, 386 nm吸收峰的强度逐渐降低, 在261 nm处出现吸收峰, 这一光谱变化对应于东莨菪内酯的内酯水解开环, 详见图5。

图2 pH对异东莨菪内酯吸收光谱的影响 (a, b, c) 和吸收强度与pH的关系(d)Fig.2 Absorption spectra of isoscopoletin at different pHs (a, b, c) and the relationship between absorption intensity and pH (d)

图3 异东莨菪内酯的电离和水解反应Fig. 3 Hydrolysis and dissociation reactions of isoscopoletin

图4 pH对东莨菪内酯吸收光谱的影响(a, b, c)和吸收强度与pH的关系(d)Fig.4 Absorption spectra of scopoletin at different pHs (a, b, c) and the relationship between absorption intensity and pH (d)

图5 东莨菪内酯的电离和水解反应Fig. 5 Hydrolysis and dissociation reactions of scopoletin

同法计算东莨菪内酯7-OH质子的电离常数 (pKa) 为7.50 ± 0.02, 与文献[17]报道的解离常数 (pKa= 7.44 ± 0.01) 结果基本一致。

异东莨菪内酯和东莨菪内酯为位置同分异构体。 二者分子型体的吸收峰峰形基本一致, 异东莨菪内酯最大吸收峰的波长红移5 nm, 说明羟基和甲氧基位置互换, 对分子型体的吸收光谱影响不显著; 当羟基解离成离子型体, 最大吸收峰的波长接近, 但两种型体的吸收峰数目和位置均不同; 内酯开环的水解产物吸收峰的数目和位置也不同, 说明羟基和甲氧基位置互换对离子型体和水解产物的吸收光谱影响显著。 异东莨菪内酯和东莨菪内酯离子型体吸收光谱的差异性主要与羟基所处的位置有关, 7-OH解离后得到的氧负离子离域到苯并吡喃酮环, 形成的n-π共轭程度大, 离子型体更稳定, 7-OH中O与H之间的结合力弱, 测定的解离常数小, 所以更容易解离; 异东莨菪内酯的6-OH, 受到分子结构的影响, O与H之间的结合力相对较强, 解离常数比较大, 不易解离。 综上, 异东莨菪内酯和东莨菪内酯吸收峰的差异与羟基所处的位置有关, 可以根据二者在碱性条件下吸收光谱的差异进行化合物的鉴别。

2.3 pH对异东莨菪内酯水溶液荧光的影响

分别测定了中性和碱性条件下异东莨菪内酯的三维荧光图谱, 见图6。

图6 异东莨菪内酯中性溶液(a)和碱性溶液溶液(b)的三维荧光图谱Fig.6 3D fluorescence spectra of isoscopoletin in neutral solution (a) and alkaline solution (b)

在中性条件下,异东莨菪内酯的激发峰(λex)分别为230、290、340 nm, 发射峰 (λem) 均为435 nm, 为分子型体的荧光峰。 在碱性条件下, 异东莨菪内酯的激发峰分别为230、288、356 nm, 发射峰均为450 nm, 为离子型体的荧光峰。

分别测定了溶液酸碱度对异东莨菪内酯分子型体和离子型体荧光光谱的影响, 见图7和图8。

图7 pH对异东莨菪内酯(分子型体)荧光光谱的影响(a, b)和荧光强度与pH的关系 (c)Fig.7 Fluorescence spectra of isoscopoletin (molecular form) at different pHs (a, b) and the relationship between fluorescence intensity and pH (c)

图8 pH对异东莨菪内酯(离子型体)荧光光谱的影响 (a, b) 和荧光强度与pH的关系 (c)Fig.8 Fluorescence spectra of isoscopoletin (ionic form) at different pHs (a, b) and the relationship between fluorescence intensity and pH (c)

由图7可知, 异东莨菪内酯水溶液分子型体的荧光峰峰形没有变化, 只是荧光强度随着溶液pH的变化而呈现有规律的变化。 当pH 2.07～ 6.30, 异东莨菪内酯水溶液的荧光强度最强且稳定; 当pH 7.29～ 11.90, 随着pH逐渐升高, 分子型体的荧光强度逐渐降低, 6-OH的氢质子开始解离; 当pH >12.0, 异东莨菪内酯的荧光强度很弱, 335 nm的激发峰基本消失, 发射峰波长逐渐红移, 发射峰红移至456 nm, 内酯环发生断裂开环。 以硫酸奎宁为参比, 在激发波长340 nm处，测得异东莨菪内酯分子型体 (pH = 5.87) 的荧光量子产率为0.15。

由图8可知, 异东莨菪内酯水溶液离子型体的荧光峰随着溶液pH的变化而呈现有规律的变化。

当pH 2.07～ 9.12, 异东莨菪内酯水溶液的荧光强度变化不大, 激发峰和发射峰的波长逐渐红移; 随着pH逐渐升高, 6-OH开始解离, 异东莨菪内酯分子型体的荧光强度逐渐增强, 当pH为10.16附近时, 荧光强度达到最强, 最大激发和发射波长分别为356 nm和450 nm; 当pH >10.95, 激发峰和发射峰逐渐红移, 当pH >11.97, 激发峰红移至378 nm, 发射峰红移至460 nm, 这对应着水解产物的光谱变化。 以硫酸奎宁为参比, 在激发波长356 nm处，测得异东莨菪内酯离子型体 (pH = 9.26) 的荧光量子产率为0.29。

2.4 pH对东莨菪内酯水溶液荧光的影响

分别测定了中性和碱性条件下东莨菪内酯的三维荧光图谱, 如图9。

图9 东莨菪内酯中性溶液(a)和碱性溶液(b)的三维荧光图谱Fig.9 3D fluorescence spectra of scopoletin in neutral solution (a) and alkaline solution (b)

在中性条件下, 东莨菪内酯的激发峰为230、290、340 nm, 发射峰均为460 nm, 为分子型体的荧光峰。 在弱碱性条件下, 东莨菪内酯的激发峰为230 nm和378 nm, 发射峰均为460 nm, 为离子型体的荧光峰。

分别测定了溶液酸碱度对东莨菪内酯分子型体和离子型体荧光的影响, 见图10和图11。

由图10可知, 当pH > 2.04, 随着pH升高, 东莨菪内酯溶液的荧光逐渐增强, 当pH为5.27～6.52时, 荧光达到最强且稳定, 这是分子型体的荧光峰 (λex/λem:340/460 nm)，与文献[18]中测定荧光峰 (λex/λem:343/462 nm)基本一致; 当pH > 6.52,东莨菪内酯水溶液的荧光强度随pH升高而逐渐降低, 激发波长从340 nm红移至378 nm, 发射波长460 nm没有变化, 7-OH逐渐电离, 逐渐形成离子型体; 当pH为 11.83～13.0时, 荧光降低且基本稳定。 以硫酸奎宁为参比, 在激发波长340 nm处, 测得东莨菪内酯分子型体 (pH = 6.02) 的荧光量子产率为0.48。

由图11可知, 当pH为1.87～5.81时, 荧光比较弱, 荧光强度变化不大; 当pH>6.37 , 东莨菪内酯溶液的荧光随着pH变大而迅速增强, 当pH在9.21～10.89区间, 荧光达到最强而稳定, 这一荧光对应着离子型体的荧光(λex:378 nm) ，与文献[18]测定的激发峰 (λex:388 nm)有差异，可能与样品、仪器等多种因素有关，但是荧光强度随pH变化的趋势基本一致; 当pH >11.76,东莨菪内酯水溶液的荧光强度随pH升高而逐渐降低, 激发波长和发射波长 (λex/λem:378 /460 nm) 没有变化, 内酯环水解发生开环反应。 以硫酸奎宁为参比, 在激发波长378 nm处, 测得东莨菪内酯阴离子的弱碱性溶液 (pH = 9.58) 荧光量子产率为0.65, 为强荧光物质, 比文献[21]报道的荧光量子产率略低 (Yf: 0.71) 。

图10 pH对东莨菪内酯(分子型体)荧光光谱的影响 (a, b) 和荧光强度与pH的关系 (c)Fig.10 Fluorescence spectra of scopoletin (molecular form) at different pHs (a, b) and the relationship between fluorescence intensity and pH (c)

图11 pH对东莨菪内酯(离子型体)荧光光谱的影响 (a, b) 和荧光强度与pH的关系 (c)Fig.11 Fluorescence spectra of scopoletin (ionic form) at different pHs (a, b) and the relationship between fluorescence intensity and pH (c)

在中性条件下, 异东莨菪内酯的最大激发峰和发射峰 (λex/λem) 为340 /435 nm, 东莨菪内酯的最大激发峰和发射峰 (λex/λem) 为340/460 nm, 东莨菪内酯比异东莨菪内酯的发射峰波长红移了约25 nm; 在碱性条件下, 异东莨菪内酯的最大激发峰和发射峰 (λex/λem) 为356/450 nm, 东莨菪内酯的最大激发峰和发射峰(λex/λem) 为378/460 nm, 东莨菪内酯比异东莨菪内酯的激发峰红移了约22 nm, 发射峰红移了约10 nm。 东莨菪内酯接近pH=12时开始水解，异东莨菪内酯接近pH=11时开始水解，文献 [21]指出内酯环强碱水解反应的速率与C-7位取代基的性质有关，当有羟基存在，可使羰基碳难以接受OH-的亲核反应，所以东莨菪内酯 (7-OH) 比异东莨菪内酯 (7-OCH3) 更难于水解。测定结果表明, 东莨菪内酯分子型体和离子型体的荧光量子产率比相应的异东莨菪内酯都大。 基于此, 东莨菪内酯的分子型体和离子型体的荧光峰比东莨菪内酯的波长更长, 因此形成的共轭体系更稳定。

2.5 溶剂对异东莨菪内酯和东莨菪内酯溶液荧光的影响

在近中性条件下, 考察了溶剂 (水溶液中甲醇的体积分数) 对异东莨菪内酯和东莨菪内酯溶液荧光的影响, 结果见图12和图13。

c: 1.03 mg/L, λex/λem: 340/435 nm图12 甲醇对异东莨菪内酯荧光光谱(a)和荧光强度的影响(b)Fig.12 Influence of methanol on fluorescence spectra(a) and fluorescence intensity of isoscopoletin(b)

c: 9.3 μg/L, λex/λem:340/460 nm图13 甲醇对东莨菪内酯荧光光谱(a)和荧光强度的影响(b)Fig.13 Influence of methanol on fluorescence spectra (a) and fluorescence intensity of scopoletin(b)

由图12可知, 异东莨菪内酯溶液中随着甲醇体积分数的增加, 最大激发波长和最大发射波长均未发生变化, 但是荧光强度随着甲醇的含量增加而大大增强。 说明甲醇溶剂对荧光的影响比较大, 这是甲醇的溶剂化效应, 甲醇溶剂环境使异东莨菪内酯的分子结构稳定, 从而使荧光强度增强。 基于此, 测定异东莨菪内酯溶液荧光时, 溶液中甲醇的含量保持一致。

由图13可知, 东莨菪内酯溶液中随着甲醇体积分数的增加, 最大激发波长未发生变化, 最大发射波长从457 nm蓝移到417 nm, 荧光强度迅速降低, 甲醇的含量对东莨菪内酯荧光的影响比较大。 甲醇所形成的微环境, 不利于东莨菪内酯分子结构稳定, 从而使荧光强度迅速降低。 因此, 测定东莨菪内酯溶液荧光时, 甲醇的含量不能超过20%。

3 结论

异东莨菪内酯和东莨菪内酯是一对同分异构体, 在不同条件下(酸碱度、溶剂)吸收光谱和荧光光谱具有显著差异。 吸收光谱中, 异东莨菪内酯和东莨菪内酯分子型体的紫外吸收光谱基本一致, 羟基解离后离子型体的吸收光谱波长和峰形差异性比较大, 解离分数表明异东莨菪内酯 (6-OH, pKa= 9.14 ± 0.02) 不容易解离, 东莨菪内酯相对容易解离 (7-OH, pKa= 7.50 ± 0.02); 在强碱性条件下, 分子结构中内酯环水解, 二者的紫外吸收光谱同样具有明显的差异性。 荧光光谱中, 异东莨菪内酯和东莨菪内酯的分子型体都具有荧光, 激发波长基本一致, 东莨菪内酯的发射波长红移; 异东莨菪内酯和东莨菪内酯的离子型体也具有荧光, 但是东莨菪内酯的最大激发波长和发射波长有不同程度的红移, 说明东莨菪内酯分子共轭程度高。 溶剂对二者的荧光光谱和荧光强度影响不同, 随着甲醇含量的增加, 东莨菪内酯的激发波长不变,发射波长发生蓝移, 荧光强度逐渐减弱, 而异东莨菪内酯仅荧光强度随之迅速增强。 异东莨菪内酯和东莨菪内酯的紫外光谱和荧光光谱的差异性与分子结构中羟基所处位置有关, 羟基在6位和7位电离后所形成的n-π共轭体系具有差异性。 利用异东莨菪内酯和东莨菪内酯吸收光谱和荧光光谱的差异性, 可以为中药材中二者的分别定量分析提供研究基础。