复方中药制剂中连翘苷提取工艺的比较研究

王彦辉，姬星宇，焦金英，李自波，高媛媛

（1.河南中盛动物药业有限公司，河南 郑州 450008；2.河南普华基因科技有限公司）

随着禁抗时代到来，全面减抗成为未来发展趋势，而中兽药成为比较合适的替代抗生素的药品，因此，这也为中兽药新药研发带来了更好的机会。但是全新的中兽药研发“投入大，产出小”，且安全性也有待考察，为了缩短新兽药的开发周期，降低风险并提高新兽药开发的成功率，“老药新用”、“人药转兽药”越来越受到关注，传统经典名方、秘方验方的再开发也是新兽药研发的重要途径。清热灵颗粒，先收载于《卫生部颁药品标准》，后收录于《中国药典》一部中，其主要作用为清热解毒，用于感冒热邪壅肺证，临床试验表明，其对鸡感冒引起的发热具有一定的治疗作用。

清热灵颗粒处方组成为黄芩、连翘、大青叶和甘草等几味中药成分。清热灵颗粒质量标准中，黄芩苷为制剂含量控制指标，黄芩苷在黄芩药材中含量较高，超过8%，传统的水提工艺较易达到含量控制指标。但是连翘同样作为方剂中的主要成分，药材本身含连翘苷成分较少，不超过3%，因此，在保证黄芩苷含量的情况下，怎样尽可能高地将制剂中其他成分提取出来，提高多成分含量，保证制剂治疗效果，也是中兽药研发的重要工作。本文将通过比较分煎、合煎、醇提、超声提等提取方式，以确定复方制剂中连翘的最佳提取工艺。

1 材料

1.1 试药

黄芩、连翘、大青叶、甘草等药材，均购自张仲景大药房；连翘苷对照品，批号：110821-201514，购自中国食品药品检定研究院；95%乙醇，分析纯，天津市北辰方正试剂厂；甲醇，色谱纯，天津市四友精细化学品有限公司；乙腈，色谱纯，美国天地化学试剂公司；中性氧化铝，分析纯，福晨（天津）化学试剂有限公司。

1.2 仪器

高效液相色谱仪（赛默飞世尔科技有限公司）、色谱柱Hypersi1 GOLD C18（赛默飞世尔科技有限公司）、BT125D电子天平（0.00001 g）（德国塞多利斯公司）、pH-3C 数字酸度仪（上海雷磁仪器厂），中药提取设备（东华原医疗设备有限公司），旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂），超声清洗仪（昆山市超声仪器有限公司）。

2 方法

2.1 分煎法

取连翘药材250 g，浸泡0.5 h后，加12倍水煎煮2次，每次1.5 h；另取黄芩250 g、大青叶250 g 和甘草50 g，浸泡0.5 h后，加12倍水煎煮2次，每次1.5 h，合并连翘和另外3种药材煎液，浓缩至800 m1，使生药含量为1 g/m1。

2.2 合煎法

取黄芩、连翘、大青叶药材各250 g，甘草50 g，浸泡0.5 h后，加12倍水煎煮2次，每次1.5 h，合并2次煎液，过滤，滤液浓缩至800 m1，使生药含量为1 g/m1。

2.3 乙醇回流提取法

取黄芩、连翘、大青叶药材各250 g，甘草50 g，按料液比1∶10加入85%乙醇，浸泡0.5 h，回流提取2次，每次1.5 h，合并两次收集的提取液，过滤，滤液旋转蒸发仪减压蒸发浓缩至800 m1，使生药含量为1g/m1。

2.4 超声提取法

取黄芩、连翘、大青叶药材各250 g，甘草50 g，粉碎，按料液比1∶10加入75%乙醇，浸泡0.5 h，超声提取2次，每次30 min，合并两次收集的提取液，过滤，滤液旋转蒸发仪减压蒸发浓缩至800 m1，使生药含量为1 g/m1。

2.5 样品溶液制备

2.5.1 对照品溶液制备 取连翘苷对照品适量，精密称定，加50%甲醇制成每1 m1含100 μg的溶液，即得。

2.5.2 供试品溶液制备 精密量取提取液1 m1，置中性氧化铝柱（100～120目，6 g，内径为1 cm）上，用70%乙醇40 m1洗脱，收集洗脱液，浓缩至干，残渣加甲醇适量使溶解，转移至5 m1量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得。

2.5.3 色谱条件 色谱柱：Hypersi1 GOLD C18（4.6mm×250 mm，5 um）；以乙腈-0.2%磷酸溶液（25∶75）为流动相，等度洗脱；流速为1 m1/min，检测波长为277 nm；进样量为10 u1。

2.6 方法学考察

2.6.1 线性关系考察 取连翘苷对照品适量，制成终质量浓度为0.4 mg/m1 的溶液，取此对照品溶液依次倍比稀释成质量浓度为0.2、0.1、0.05、0.025、0.012 5 mg/m1 的溶液，HPLC 分别进样检测，记录色谱图，以对照品溶液的质量浓度为横坐标（x），以平均峰面积为纵坐标（y），绘制标准曲线，计算回归方程、相关系数和线性范围。

2.6.2 精密度试验 取连翘苷对照品溶液，连续重复进样6次，记录峰面积，并计算相对标准偏差（RSD）。

2.6.3 重复性试验 取提取液，平行制备供试品溶液6份，HPLC 进样检测，记录峰面积，并计算相对标准偏差（RSD）。

2.6.4 稳定性试验 取提取液，制备供试品溶液，分别于配制完成后第0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h进样检测，记录峰面积，计算RSD。

2.6.5 加样回收率 准确称取同一批已测知含量的提取液9 份，制备供试品溶液，按对照品加入量与所提取液中连翘苷含量比为1∶0.5、1∶1、1∶1.5，分别加入连翘苷对照品，每个浓度3个重复，记录峰面积，计算回收率及RSD。

2.6.6 提取液含量测定 分别取4 个不同提取工艺所得提取液，以上述“2.5.2”项下方法制备供试品溶液，按上述“2.5.3”项下色谱方法，HPLC进样检测，记录峰面积，计算提取液中连翘苷含量。

3 结果分析

3.1 线性关系考察结果

连翘苷线性关系考察结果如图1所示，所得线性回归方程为：y=1E+07x+3 084.7，R2=1，说明在0.012 5～0.4 mg/m1范围内，线性关系良好。连翘苷标准曲线见图1。

图1 连翘苷标准曲线

3.2 精密度试验结果

取连翘苷对照品溶液，连续重复进样6 次，所得精密度试验结果如表1 所示，测得连翘苷对照品溶液RSD 为0.2%，表明仪器精密度良好。

表1 精密度试验结果

3.3 重复性试验结果

取提取液，平行制备供试品溶液6 份，所得重复性试验结果如表2所示，测得连翘苷对照品溶液RSD为0.9%，表明该试验的测定方法重复性良好。

表2 重复性试验结果

3.4 稳定性试验结果

取提取液，制备供试品溶液，分别于配制完成后0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h进样检测，检测结果如表3所示，样品溶液放置24 h 后，连翘苷含量为0.42 mg/m1，与0 h 比，无显著下降，RSD 为1.28%，表明样品溶液在24 h 内比较稳定。

表3 样品溶液稳定性试验

3.5 加样回收率试验结果

回收率试验结果见表4，由表4 可见，不同加样浓度，样品平均加样回收率为99.5%，RSD 为0.8%，说明该检测方法准确度良好。

表4 回收率试验结果

3.6 提取液含量检测结果

经以上方法学考察验证后，不同提取方式所得清热灵颗粒提取液中连翘苷含量测定结果如表5所示，合煎所得连翘苷含量较高，为0.41 mg/m1，分煎则次之，为0.37 mg/m1，乙醇回流提取和超声提取所得连翘苷含量较低，仅为0.30 mg/m1和0.28 mg/m1，说明采用整体投料，传统水提工艺提取所得连翘苷提取率最高，提取率达66.6%。

表5 不同提取方法连翘苷含量测定结果

4 讨论

清热灵颗粒的处方组成是：黄芩、连翘、大青叶、甘草；方中黄芩苦寒，清肺泄热，为君药；连翘既能疏散风热，清热解毒，又可辟秽化浊，在透散卫分表邪的同时，兼顾温热病邪易蕴结成毒的特点，为臣药；大青叶清热解毒，凉血散斑，为佐药；甘草调和诸药，为使药。现代药效学研究表明，除黄芩苷外，连翘苷也具有抗菌抗病毒的相关活性，也是清热灵颗粒的药效学物质基础。本文采用不同提取工艺，包括分煎、合煎、醇提、超声提等，来比较研究连翘苷的最佳提取工艺。

煎煮法是我国最早使用的传统的提取方法，是提高煎剂质量、保障临床用药安全有效的重要环节之一，体现了中医治病的精髓。清代名医徐灵胎云：“煎药之发，最易深究，药之效不效，全在于此”。乙醇回流提取法是用乙醇等易挥发的有机溶剂提取原料成分，将浸出液加热蒸馏，其中挥发性溶剂馏出后又被冷却，重复流回浸出容器中浸提原料，这样周而复始，直至有效成分回流提取完全的方法。超声提取就是利用超声波强烈的空化、搅拌等效应，破坏植物细胞壁，减少传质阻力，使有效成分迅速溶出。本研究试验结果表明，在以上几种提取工艺中，传统水提工艺所得清热灵颗粒提取液中连翘苷含量最高，尤其是复方药材整体投料，而以乙醇为溶媒的回流提取和超声提取，则提取率相对较低，原因可能为连翘苷易溶于水，不溶于乙醇，因此采用醇提工艺，所得连翘苷提取率较低。综合比较，传统水煎工艺，操作简单，更适用于实际生产。中药复方制剂，成分复杂，每一味药材都有其药效学作用，因此，应采用合适的提取方法，尽可能地将每一味药材的有效成分充分提取出来。□