UPLC-Q-TOF-MS法分析胃炎专利方中化学成分

黄 芳， 罗辉泰， 谢淑桐， 邓 欣， 周 熙， 吴惠勤*， 黄华强， 杨素明，罗晓霞， 祁江博

[1.广东省科学院测试分析研究所(中国广州分析测试中心)，广东省化学测量与应急检测技术重点实验室，广东省中药质量安全工程技术研究中心，广东 广州 510070；2.广州今典精方药业有限公司，广东 广州 511450]

慢性胃炎是指不同病因引起的各种慢性胃黏膜炎性病变[1]，可用于治疗该疾病的中药处方有很多，但往往治疗效果不明显、复发率高。胃炎专利方是治疗慢性胃炎的经验组方，经过长期临床应用证明其效果显著、疗效稳定，该方由白芍、桂枝、高良姜、黄连组成，具有疏肝和胃、缓急止痛的功效。目前该专利方质量的控制是按照2020年版《中国药典》单味饮片的要求，但是中药具有多成分、多靶点的特点，测定单一成分难以反映整体质量，所以认识其药效物质基础并明确其作用机制成为重中之重。UPLC-Q-TOF-MS法兼具UPLC快速、高效的分离特性和Q-TOF-MS高分辨率、高灵敏度的定性分析特点，能够实现复杂样品的快速分离和多成分的准确定性分析，而且已有报道采用该方法鉴定专利方中的4味药材或其他复方中的化学成分[1-4]，基于此，本研究采用UPLC-Q-TOF-MS技术，分析胃炎专利方汤剂中的成分，并对其来源进行归属，以期为胃炎专利方质量控制的主要指标成分提供依据，对其质量控制提供有效的检测指标，为扩展其临床应用及质量控制提供科学依据。

1 材料

1.1 仪器 Agilent1290 UPLC-6540-Q-TOF-MS配有双喷射流电喷雾离子源(美国Agilent公司)；TP-114型电子天平(德国Sartorious公司)；Allegra 64R型高速冷冻离心机(美国Beckman公司)；RE-52AA型旋转蒸发器(上海亚荣生化仪器厂)；煎药壶(广州今典精方药业有限公司)。

1.2 试剂 没食子酸(批号110831-201204，纯度90.8%)、乔松素(批号111829-201703，纯度99.5%)、高良姜素(批号111699-200501，纯度98.5%)、儿茶素(批号110877-201604，纯度99.2%)、表儿茶素(批号110878-201602，纯度99.7%)、芍药苷(批号161106-201609，纯度96.4%)、丹参素钠(批号110855-201311，纯度98.1%)对照品均购自中国食品药品检定研究院；原花青素(批号Y22F7Y17095，纯度≥95%)对照品购自上海源叶生物科技有限公司；桂皮醛(批号106718，纯度98.9%)对照品购自德国Dr.Ehrenstorfer公司。甲醇、乙醇、乙腈为色谱纯，购自德国Merck公司；甲酸、甲酸铵购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；水为蒸馏水。

1.3 药物 白芍(产地安徽)、高良姜(产地海南)、桂枝(产地广西)、黄连(产地重庆)饮片均由广州今典精方药业有限公司提供，组方生产批号181201，经专家鉴定为正品。

2 方法

2.1 检测条件

2.1.1 色谱 Shim-pack Scepter C18色谱柱(100 mm×2.1 mm，3 μm)；流动相乙腈(A)-0.1%甲酸(B)，梯度洗脱(0～5 min，100%A～0；5～20 min，0～10%A；20～30 min，10%A；30～40 min，10%～25%A；40～45 min，25%～30%A；45～55 min，30%～70%A；55～57 min，70%～100%A；57～60 min，100%A；61～68 min，100%A～0)；体积流量0.3 mL/min；柱温30 ℃；进样量5 μL。

2.1.2 质谱 电喷雾正、负离子模式，扫描范围m/z80～1 100；离子源温度350 ℃；离子喷雾电压3 000 V；离子源气体1、240 psi(1 psi=6.895 kPa)；去簇电压110 V；碰撞能10、20、40 V。

2.2 溶液制备

2.2.1 复方供试品溶液 称取1个剂量复方的中药饮片，加入800 mL水浸泡30 min，煎煮至沸腾，文火煎煮2 h，滤出药液，滤渣继续加入600 mL水，煎煮至沸腾，文火煎煮2 h，滤出药液，合并2次滤液，减压浓缩至200 mL，取50 mL浓缩液，加入甲醇至其体积分数为50%，沉淀药液(可在4 ℃以下保存1周)，10 000 r/min离心5 min，取50 mL上清液，减压浓缩至5 mL，0.22 μm微孔滤膜过滤，即得。

2.2.2 单味药材供试品溶液 取“2.2.1”项下中等量白芍、桂枝、高良姜、黄连饮片，按“2.2.1”项下方法制备，即得。

2.2.3 空白供试品溶液 在煎药壶不加药材只加水，按“2.2.1”项下方法制备，即得。

2.2.4 对照品溶液 精密称取没食子酸、乔松素、高良姜素、儿茶素、表儿茶素、芍药苷、原花青素、桂皮醛、丹参素钠对照品各5 mg，甲醇溶解并稀释至10 mL，摇匀，得贮备液，分别精密吸取1 mL，50%甲醇稀释至10 mL，摇匀，即得。为区分同分异构体，同法再制备儿茶素对照品溶液1份。

2.3 数据分析 采用UPLC-Q-TOF-MS自带软件，对图中每个色谱峰对应的精确质量数及同位素进行分析，确定离子的状态并推测分子式，根据其二级质谱的特征碎片离子，结合参考文献和Chemspider、PubChem等数据库鉴定化学成分，并根据相同类型化合物的裂解规律对首次报道者进行质谱鉴定。

3 结果

基峰色谱图见图1，共鉴定出41种成分，通过对照品比对确认了没食子酸、乔松素、高良姜素、表儿茶素、儿茶素、芍药苷、花青素二聚体和三聚体、肉桂醛、丹参素，再对其来源进行归属，结果见表1。

图1 胃炎专利方基峰色谱图

3.1 丹参素 6号峰(tR=11.82 min)准分子离子峰[M-H]-的精确质量数为197.045 6，推测分子式为C9H10O5，其精确质量数理论值197.045 5与实测值误差为0.5×10-6，二级质谱见图2，主要生成碎片离子m/z179.034 6、151.039 4、135.045 3、123.045 1、72.993 5等。质谱裂解规律为准分子离子m/z197.045 6失去1份子HCOOH产生m/z151.039 4的碎片离子；或失去1分子H2O产生m/z179.034 6的碎片离子，再失去1分子-COO产生135.045 3的碎片离子；或C-C键断裂得到m/z123.045 1、72.993 5的碎片离子。综上所述，推测该化合物为丹参素，与相应对照品比对一致。另外，8号峰(tR=13.69 min)与6号峰精确质量数相差162.051 9，可能是其母离子失去1分子葡萄糖残基而得，其余碎片离子信息均与6号峰一致(图3)，推测为6号峰的葡萄糖苷化合物。丹参素裂解途径见图4。

图2 6号峰二级质谱图

图3 8号峰二级质谱图

表1 胃炎专利方化学成分和药材归属

图4 丹参素裂解途径

3.2 原花青素二聚体 12号峰(tR=23.36、24.36 min，推测两者为同分异构体)二级质谱图见图5，准分子离子峰[M-H]-的精确质量数为577.136 7，推测分子式为C30H26O12；其精确质量数理论值为577.135 1，与实测值误差为2.8×10-6；二级质谱主要生成碎片离子m/z451.102 3、425.087 6、407.076 2、289.070 9、125.024 6等。质谱裂解规律为准分子离子m/z577.136 7发生RDA反应分别产生m/z451.102 3、425.087 6的碎片离子，m/z425.087 6失去1分子H2O得到m/z407.076 2的碎片离子；或发生C-C键断裂产生m/z289.070 9的碎片离子；或C环开环后产生m/z289.070 9的碎片离子；或失去1个间苯三酚，形成m/z125.024 6的碎片离子。综上所述，推测12号峰为原花青素二聚体，裂解途径见图6。

3.3 乔松素 37号峰(tR=51.80 min)准分子离子的精确质量数为257.080 3，推测分子式为C15H12O4，离子状态为[M+H]+，二级质谱图见图7，含碎片离子m/z153.018 0、131.048 7、103.054 2等，其吡喃环(C环)以不同断裂方式分别产生m/z153.018 0、131.048 7的碎片离子，后者失去1分子CO得到m/z103.054 2的碎片离子。综上所述，推测该化合物为乔松素，与相应对照品比对一致，裂解途径图见图8。

图5 12号峰二级质谱图

图6 原花青素二聚体的裂解途径

4 讨论

本研究对样品前处理方法进行优化，为了保证测定成分与病人服用的成分一致性，选择煎药罐煎出汤剂，旋转蒸发浓缩得到中药提取液，过滤后进样测定，测得的色谱图基线噪音高、分离不理想，这可能是由于药材本身含有的蛋白质、多糖、黏液质等大分子杂质的影响。而且，水提液直接测试容易导致色谱柱柱压升高，因此，在提取液中加入甲醇至体积分数为50%后离心处理，取上清液减压浓缩后进样测定，得到相对理想的色谱峰。

图7 37号峰二级质谱图

图8 乔松素部分裂解途径

中药汤剂历经数千年发展，延用至今，以水为溶剂，价廉易得，尤其对一些慢性病、疑难杂症等均有很好的疗效[19]，且中药汤剂只需简单的煎煮提取，能更大程度地保全化学成分和活性物质。小檗碱可用于消化性溃疡、胃炎、肠炎、腹泻等消化系统疾病的治疗[20]；桂皮醛有健胃益脾、调理肠胃的作用，通过细胞保护和胃碳酸氢盐屏障加强机制起到预防胃黏膜损伤的作用[21]；高良姜素具有镇痛、止呕的作用，其中的二芳基庚烷类化合物具有对抗幽门螺旋杆菌的药理活性[22]；芍药苷、芍药内酯苷、苯甲酰芍药苷等单萜苷类化合物被认为是白芍的重要药效物质[23]。由此可见，本研究鉴定出得到的成分均有可能是在体内产生药效作用的物质，具有治疗胃病相关的药理作用。明确这些成分，完善其药效物质基础研究，可为筛选产品质量控制指标提供依据，现有研究结果可以为胃炎专利方深入研究及推广提供前期数据支持。