姜黄素对高糖诱导糖耐量受损大鼠细胞NRK-52E增殖及凋亡的作用

谢雯雯， 何志凌， 招煦杰， 罗 锐

(广州中医药大学第二临床医学院，广东 广州 510000)

糖尿病肾病是临床常见的一种慢性肾脏疾病，我国糖尿病肾病发病率逐年上升，其发展为终末期肾衰竭的病理基础主要为肾小管间质纤维化，目前糖尿病肾病发病机制尚未阐明，炎症反应、细胞凋亡及氧化应激等是诱发糖尿病肾病的重要原因[1]。中药活性成分具有抗氧化、抗炎等作用，并可减轻糖尿病肾病等引发的肾损伤[2-3]。姜黄是姜科姜黄属植物，姜黄素是从姜黄中提取的物质，为黄色酸性酚类物质，具有抗氧化、抗炎、抗肿瘤的作用，还可抑制软骨细胞凋亡从而减轻细胞损伤[4]，但姜黄素对糖尿病肾病的影响及其可能作用机制尚未阐明。长链非编码RNA(lncRNA)在肾损伤中发挥重要调控作用[5]，长链非编码RNA TUG1(lncRNA TUG1)在糖尿病心肌病中表达降低，并可能参与糖尿病心肌病发生及发展过程[6]，但TUG1是否介导姜黄素影响糖尿病肾病发生过程尚未可知。因此，本研究以大鼠近端肾小管上皮细胞NRK-52E为研究对象，采用高糖诱导NRK-52E细胞建立细胞损伤模型，探讨姜黄素对高糖诱导NRK-52E细胞增殖及凋亡的影响。

1 材料

1.1 细胞 大鼠近端肾小管上皮细胞NRK-52E，购自上海弘顺生物科技有限公司。

1.2 试剂与药物 姜黄素对照品(纯度≥95%，上海信裕生物科技有限公司)；葡萄糖(华仁药业股份有限公司)；DMEM培养液(上海钰森生物技术有限公司)；胎牛血清(杭州亦博生物科技有限公司)；MTT试剂(上海歌凡生物科技有限公司)；细胞凋亡检测试剂盒(上海瓦兰生物科技有限公司)；Lipofectamine2000(上海信帆生物科技有限公司)；Trziol、反转录、RT-qPCR试剂[天根生化科技(北京)有限公司]；pcDNA、pcDNA-TUG1(上海索宝生物科技有限公司)；si-NC、si-TUG1(广州锐博生物科技有限公司)；caspase-3、Bax、Bcl-2抗体(美国Santa Cruz公司)；HRP标记的山羊抗兔IgG二抗(武汉艾美捷科技有限公司)。

2 方法

2.1 分组及干预 模型组加入30 mmol/L葡萄糖[7]；对照组加入5.5 mmol/L葡萄糖培养；低、中、高剂量姜黄素组分别加入20、40、80 μmol/L姜黄素和30 mmol/L葡萄糖[8]，培养24 h。后续实验分别将pcDNA、pcDNA-TUG1转染至NRK-52E细胞，并加入30 mmol/L葡萄糖培养24 h，分别记作pcDNA组、pcDNA-TUG1组；分别将si-NC、si-TUG1转染至NRK-52E细胞，加入80 μmol/L姜黄素与30 mmol/L葡萄糖培养24 h，分别记作高剂量姜黄素+si-NC组、高剂量姜黄素+si-TUG1组。

2.2 MTT检测细胞存活率 调整NRK-52E细胞密度为3×105/mL，每孔100 μL接种于96孔板，按“2.1”项下分组培养24 h，加入20 μL MTT溶液，室温孵育4 h，弃上清，加入150 μL DMSO，室温振荡孵育10 min，采用酶标仪检测490 nm波长处各孔光密度值(OD)，并计算细胞存活率。

2.3 流式细胞术检测细胞凋亡率 NRK-52E细胞接种于6孔板，每孔3×104个细胞，按“2.1”项下分组培养24 h，收集各组NRK-52E细胞，按照凋亡检测试剂盒说明书检测细胞凋亡率。

2.4 RT-qPCR检测细胞中TUG1表达 收集各组细胞，采用Trizol法提取各组NRK-52E细胞中的总RNA。参照反转录试剂盒将RNA反转录合成cDNA，以cDNA为模板进行RT-qPCR反应，采用2-ΔΔCT法计算TUG1相对表达量。

2.5 Western blot检测细胞中caspase-3、Bax、Bcl-2蛋白表达 收集各组细胞，加入400 μL RIPA裂解液提取细胞总蛋白，采用BCA法检测蛋白浓度，取40 μg蛋白样品进行SDS-PAGE电泳反应，转膜，封闭，加入一抗稀释液(1∶1 000)，4 ℃孵育24 h，使用TBST洗涤，加入二抗稀释液(1∶2 000)，室温孵育1 h，使用TBST洗涤，暗室内曝光显影，采用Image J软件分析各条带灰度值。

3 结果

3.1 姜黄素对高糖诱导NRK-52E细胞活力的影响 与对照组比较，模型组细胞存活率降低(P<0.05)；与模型组比较，各剂量姜黄素组存活率均升高(P<0.05)，且呈剂量依赖性，见表1。

表1 姜黄素对高糖诱导NRK-52E细胞存活率的影响

3.2 姜黄素对高糖诱导NRK-52E细胞凋亡的影响 与对照组比较，模型组细胞凋亡率和caspase-3、Bax蛋白表达升高(P<0.05)，Bcl-2蛋白表达降低(P<0.05)；与模型组比较，各剂量姜黄素组细胞凋亡率和caspase-3、Bax蛋白表达降低(P<0.05)，Bcl-2蛋白表达升高(P<0.05)，且呈剂量依赖性，见图1、表2。

图1 姜黄素对高糖诱导NRK-52E细胞凋亡率(A)及凋亡相关蛋白表达(B)的影响

表2 姜黄素对高糖诱导NRK-52E细胞凋亡的影响

3.3 姜黄素对高糖诱导NRK-52E细胞中TUG1表达的影响 与对照组比较，模型组细胞中TUG1的表达降低(P<0.05)；与模型组比较，各剂量姜黄素组细胞中TUG1的表达升高(P<0.05)，且呈剂量依赖性，见表3。

表3 姜黄素对高糖诱导NRK-52E细胞中TUG1表达的影响

3.4 过表达lncRNA TUG1对高糖诱导NRK-52E细胞活力的影响 与pcDNA组比较，pcDNA-TUG1组细胞存活率升高(P<0.05)，见表4。

表4 过表达lncRNA TUG1对高糖诱导NRK-52E细胞活力的影响

3.5 过表达lncRNA TUG1对高糖诱导NRK-52E细胞凋亡的影响 与pcDNA组比较，pcDNA-TUG1组细胞凋亡率和caspase-3、Bax蛋白表达降低(P<0.05)，Bcl-2蛋白表达升高(P<0.05)，见图2、表5。

图2 过表达lncRNA TUG1对NRK-52E细胞凋亡率(A)及凋亡相关蛋白表达(B)的影响

表5 过表达lncRNA TUG1对高糖诱导NRK-52E细胞凋亡的影响

3.6 干扰lncRNA TUG1能逆转姜黄素对高糖诱导NRK-52E细胞活力和凋亡的影响 与高剂量姜黄素+si-NC组比较，高剂量姜黄素+si-TUG1组细胞存活率和Bcl-2蛋白表达降低(P<0.05)，细胞凋亡率和caspase-3、Bax蛋白表达升高(P<0.05)，见表6～7、图3。

表6 干扰lncRNA TUG1能逆转姜黄素对高糖诱导NRK-52E细胞活力的影响

表7 干扰lncRNA TUG1能逆转姜黄素对高糖诱导NRK-52E细胞凋亡的影响

图3 干扰lncRNA TUG1对NRK-52E细胞凋亡率(A)及凋亡相关蛋白表达(B)的影响

4 讨论

姜黄素属于酚类物质，其具有抗炎、抗氧化及抗肿瘤等作用，研究表明姜黄素可抑制氧化应激从而减轻神经细胞损伤[9]；还可抑制NF-κB信号通路从而减轻心肌细胞氧化应激损伤及缺血再灌注损伤[10]；可通过清除氧自由基而抑制溃疡性结肠炎的发展[11]。本研究结果显示高糖诱导的NRK-52E细胞存活率降低，不同剂量姜黄素处理后可提高细胞存活率，提示姜黄素可促进高糖诱导的NRK-52E细胞增殖。细胞凋亡与Bcl-2/Bax比值失衡有关，Bcl-2表达下调与Bax表达上调可促进细胞凋亡[12]。本研究结果显示高糖诱导后NRK-52E细胞凋亡率、caspase-3、Bax蛋白表达升高，而Bcl-2蛋白表达降低，姜黄素可减弱细胞凋亡能力，提示姜黄素可明显抑制高糖诱导的NRK-52E细胞凋亡进而减轻细胞损伤。

TUG1在肾损伤中表达降低，上调其表达可减轻肾损伤[13]。黄芪甲苷可通过上调TUG1的表达而抑制糖尿病肾病大鼠足细胞凋亡[14]。TUG1表达上调可通过抑制miR-21而促进TIMP3表达进而改善糖尿病肾病[15]。本研究结果显示高糖诱导的NRK-52E细胞中TUG1的表达降低，而姜黄素可促进TUG1表达，进一步研究显示TUG1过表达可提高高糖诱导的NRK-52E细胞增殖，降低细胞凋亡率。同时本研究进一步证实抑制TUG1表达可明显逆转姜黄素对高糖诱导的NRK-52E细胞增殖及凋亡的作用，首次证实姜黄素调控高糖诱导的NRK-52E细胞增殖及凋亡的过程中TUG1发挥的重要作用。

综上所述，姜黄素可促进高糖诱导的NRK-52E细胞增殖及抑制细胞凋亡进而减轻细胞损伤，其作用机制与上调TUG1的表达有关，但关于其具体作用机制仍需深入研究。