桔梗中PgMCT和PgCMK的克隆及原核表达分析

刘梦丽， 余函纹， 李 景， 徐 睿， 吴君贤， 彭华胜,2， 查良平*， 桂双英,3,4,5*

(1.安徽中医药大学药学院，安徽 合肥 230012；2.中国中医科学院中药资源中心，道地药材国家重点实验室培育基地，北京 100700；3.安徽省中医药科学院药物制剂研究所，安徽 合肥 230012；4.现代药物制剂安徽省教育厅工程技术研究中心，安徽 合肥 230012；5.药物制剂技术与应用安徽省重点实验室，安徽 合肥 230012)

桔梗为桔梗科植物桔梗Platycodongrandiflorus(Jacq)A.DC 的干燥根，始载于《神农本草经》[1]，性平，味苦、辛，归肺经[2]，具有宣肺、利咽、祛痰、排脓的功效，临床用于肺痈吐脓、咽痛音哑、胸闷不畅、咳嗽痰多[3]，是一种传统“引经”药，可载药上行直达病所[4-5]。现代研究表明，桔梗中含有皂苷、甾醇、黄酮、氨基酸、多糖及微量元素等多种化学成分[6-7]，其中三萜皂苷为其主要活性成分[8]，具有祛痰、镇咳、抗炎、保肝、抗肿瘤及免疫调节等多种药理活性[9-11]。

三萜皂苷是一类具有多种生理功能的次生代谢产物，在自然界中分布广泛[12]，其中双子叶植物中含量最佳、分布最多，可以增强植物抗病和抗虫害能力，是中药材药用有效成分的重要组分[13]。桔梗皂苷类成分均属于齐墩果烷型五环三萜皂苷[14]，通过萜类化合物的生物合成途径产生，即细胞质中甲羟戊酸途径(MVA)和质体中的甲基赤藓醇磷酸(MEP)途径[15-16]。MEP途径第一步是由1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶催化3-磷酸甘油醛和丙酮酸缩合生成1-脱氧-木酮糖-5-磷酸(DXP)，其次，由1-氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶通过还原反应将DXP催化生成MEP。随后，通过2-C-甲基-D-赤藓糖醇-4-磷酸胱氨酰转移酶(MCT)、4-(5′-焦磷酸胞苷)-2-C-甲基D-赤藓糖醇激酶(CMK)等一系列酶促反应将MEP磷酸化、环化等生成异戊烯基焦磷酸(IPP)与二甲基烯丙基焦磷酸(DMAPP)[17-19]。

目前，MCT和CMK基因已经从多种植物中成功克隆，例如巴西[20]、杜仲[21]、银杏[22]、南方红豆杉[23]、黄花蒿[24]，而桔梗MCT和CMK基因尚未有报道。本文首次从桔梗中克隆得到MEP途径的关键酶基因PgMCT和PgCMK的全长序列，进行序列分析，构建原核表达载体并转化到大肠杆菌中进行诱导表达，为深入研究桔梗三萜皂苷的生物合成分子机制奠定基础。

1 材料

1.1 药材 桔梗来源于安徽省桐城市唐湾镇013县道，采取2年生桔梗，收集根、茎和叶，经液氮速冻，保存于-80 ℃冰箱。

1.2 细胞与试剂 Trans1-T1感受态细胞、Transetta(DE3)感受态细胞购自于北京全式金生物技术有限公司。原核表达载体购自于武汉淼灵生物科技有限公司，引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

2 方法

2.1 基因数据获取 桔梗PgMCT和PgCMK基因序列来源于桔梗转录组数据(本实验室)，经冗余序列去除和组装，功能注释后分类。GenBank数据库获取其他物种的MCT和CMK氨基酸序列。

2.2 总RNA的提取和cDNA的合成 以桔梗根部为材料，根据RNA prep Pure Plant Kit试剂盒说明书提取得到桔梗根部总RNA，电泳检测桔梗总RNA的完整性，ND2000(Denovix DS-11+, S-03512)测定RNA的A260和A280值，以桔梗RNA为模板进行反转录，得到桔梗cDNA。

2.3 桔梗PgMCT和PgCMK基因的克隆 根据桔梗转录组数据库，设计PgMCT和PgCMK基因特异性引物。PgMCT正向引物ATGGCAATTCTGCAAGTCTGTCTCC，反向引物TTATGATGACTCTTCAGAAGTGCCA；PgCMK正向引物ATGGCTTCAACCCAGTTGCTCAGTT，反向引物CTAATCAG CAGACACAAAAGGGTCA。以桔梗根部cDNA为模板进行PCR扩增，经电泳分离、检测，进行切胶回收。将目的基因与克隆载体于25 ℃连接3 h，转化至Trans1-T1感受态细胞，经菌液PCR验证，阳性菌液送至公司完成测序。

2.4 桔梗PgMCT和PgCMK基因的生物信息学分析 使用NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)在线工具BLAST对PgMCT和PgCMK基因序列进行同源比对分析；运用ORF Finder(https://www.ncbi.nlm. nih.gov/ orffinder/)查找基因的开放阅读框(ORF)；ExPASy(https://web.expasy.org /protparam/)预测基因编码蛋白的理化性质；利用NPS(https://npsa-prabi.ibcp.fr/ cgi-bin/ npsa_automat.pl?page=npsa_gor4.html)预测蛋白质二级结构；使用Swiss Model(http://swissmodel.expasy.org/)进行三维结构建模，结合PyMOL软件预测蛋白质的三级结构；CDD(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)预测蛋白质结构域；TMHMM(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)进行蛋白序列的跨膜结构域分析；SinalP4.0Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)进行蛋白序列的信号肽预测分析；运用ClustalW软件，将PgMCT和PgCMK氨基酸序列与其他植物的氨基酸序列进行比对，用MEGA 6.06软件构建Neighbor-joining系统进化树，bootstrap重复次数为1 000次。

2.5 桔梗PgMCT和PgCMK基因的原核表达 依据测序所得序列，在PgMCT和PgCMK基因核苷酸序列两侧设计带有BamHI酶切位点的特异性引物，PgMCT-32a-BamHI正向引物AGGCCATGGCTGATATCGGAATGGCAATTCTG CAAGTCTGTCTCC，反向引物CGACGGAGCTCGAATTCG GACTAATCAGCAGACACAAAAGGGTCA；PgCMK-28a-BamHI正向引物GACAGCAAATGGGTCGCGGAATGGCTT CAACCCAGTTGCTCAGTT，反向引物CGACGGAGCTCGA ATTCGGATTATGATGACTCTTCAGAAGTGCCA。以重组质粒为模板，经PCR扩增、检测，进行切胶回收。同时对pET-32a、pET-28a载体进行BamH Ⅰ单酶切，经电泳检测，进行切胶回收。在50 ℃条件下，目的基因与原核表达载体完成无缝拼接，产物转化至Trans1-T1感受态细胞，挑取单菌落，菌液PCR验证并挑选阳性菌液送至公司测序。将测序阳性、包含目的基因的质粒转化至大肠杆菌Transetta(DE3)中，37 ℃下至OD600值为0.6～0.8时，将pET-32a-PgMCT和pET-28a-PgCMK分别在0.8、0.4 mmol/L的IPTG条件下，28 ℃诱导12 h，收集菌液，完成SDS-PAGE检测。

3 结果

3.1 桔梗PgMCT和PgCMK基因克隆和序列分析 依据桔梗转录组数据文库PgMCT和PgCMK的基因序列分析，以桔梗cDNA为模板，经过PCR扩增，电泳分离、检测，结果显示，PgMCT基因电泳条带约为954 bp(图1A)，PgCMK基因电泳条带约为1 227 bp(图1B)。PgMCT和PgCMK基因cDNA序列分析结果显示，PgMCT基因ORF全长954 bp，编码317个氨基酸，PgCMK基因ORF全长1 227 bp，编码408个氨基酸，与目的基因条带大小一致。

PgMCT和PgCMK蛋白序列通过Genebank中BLASTX进行序列比对，结果显示，PgMCT和PgCMK与GenBank中已注册植物基因有较高的同源性，桔梗MCT与莴苣LsMCT(XP_023729231.1)同源相似性为78.91%，与猕猴桃(PSS29099.1)同源相似性为74.48%，将该基因命名为PgMCT，GenBank注册号为MZ736414。桔梗CMK与茶(XP_028107767.1)同源相似性为80.35%，与水忍冬(AGE10579.1)同源相似性为77.04%，将该基因命名为PgCMK，GenBank注册号为MZ736415。

3.2 桔梗PgMCT和PgCMK基因的生物信息学分析

3.2.1 蛋白理化性质分析 根据PgMCT和PgCMK的氨基酸序列，利用ExPASy在线工具对桔梗PgMCT和PgCMK蛋白理化性质分析，结果显示，PgMCT编码的蛋白质分子式为C1576H2516N420O479S9，编码317个氨基酸，相对分子质量35 300.38，理论pI 6.27，脂肪指数94.95，不稳定性系数(Ⅱ)为43.68；PgCMK编码的蛋白质分子式为C1978H3105N543O606S12，编码408个氨基酸，相对分子质量44 573.41，理论pI 7.54，脂肪指数81.54，不稳定性系数(Ⅱ)为44.23。理论上PgMCT和PgCMK蛋白均为不稳定蛋白。

3.2.2 蛋白二级结构和三级结构预测分析 采用NPS在线分析软件预测PgMCT和PgCMK蛋白质的二级结构(图2A、2B)，结果显示，PgMCT中含有83个α-螺旋，占比26.18%；延伸链为78个，占比 24.61%；β-转角为26个，占比8.20%；无规卷曲为130个，占比41.01%；PgCMK中含有139个α-螺旋，占比34.07%；延伸链为69个，占比16.91%；β-转角为25个，占比6.13%；无规卷曲为175个，占比42.89%，这两种蛋白的二级结构中所占比例最高的均为无规卷曲。

通过SWISS-MODEL Workspace在线软件对PgMCT和PgCMK蛋白进行同源建模，构建三维空间模型(图2C、2D)，通过ExPAsy structure assessment程序评测推导PgMCT蛋白模型2yc3.1.A 序列相似性为77.97%，GMQE值为0.62。PgCMK蛋白模型2vf3.1.A序列相似性为31.08%，GMQE值为0.45。

图2 PgMCT和PgCMK的二级和三级结构预测

3.2.3 蛋白结构功能域及跨膜结构域分析 利用NCBI的Conserved domains在线工具对PgMCT和PgCMK蛋白结构功能域进行预测分析(图3A、3B)，结果显示，PgMCT属于糖基转移酶GT-A超家族；PgCMK具有IspE功能域，属于IspE超家族。用TMHMM2.0在线工具对PgMCT和PgCMK跨膜结构域进行预测分析(图3C、3D)，结果显示，PgMCT和PgCMK均未出现跨膜结构或膜结合区域，推测这个两个蛋白为非跨膜蛋白。

图3 PgMCT和PgCMK的结构功能域和跨膜结构域

3.2.4 氨基酸序列同源比对 采用DNAMAN软件对桔梗MCT和CMK氨基酸序列进行比对，见图4。PgMCT与茶CsMCT(XP_028127240.1)、向日葵HaMCT(XP_022038869.1)、莴苣LsMCT(XP_023729231.1)、木薯MeMCT(XP_021592947.1)氨基酸序列的一致性为73.81%，5种植物MCT的N端非催化区域氨基酸序列是序列对比的主要差异，保守区主要集中在中部和尾部，具有依赖于Mg2+的底物CTP结合位点和底物MEP结合位点。将PgCMK氨基酸序列与长春花CrMCT(ABI35992.1)、杜仲EuCMK(AQZ26750.1)、水忍冬LdCMK(AGE10579.1)、山银花LhCMK(AGE10580.1)氨基酸序列的一致性为85.33%。发现PgCMK和其他植物的CMK蛋白均具有3个典型结合域Motif A、Motif B和Motif C。

图5 PgMCT和PgCMK与其他物种MCT、CMK氨基酸序列的系统进化分析

3.2.5 系统进化树分析 从GenBank数据库中选取其他植物的MCT和CMK基因的氨基酸序列，利用MEGA 6.06软件通过邻接法构建包括桔梗在内的MCT和CMK氨基酸序列的系统进化树(图5)。结果显示，系统进化树聚集为5种类型，即双子叶植物、单子叶植物、裸子植物、藻类和菌类。PgMCT与莴苣MCT、橡胶草MCT、向日葵MCT聚为一支，表明其亲缘关系最高。PgCMK与罂粟CMK、非洲相思子CMK、桑CMK、枣CMK聚为一支，表明2者具有较高的亲缘关系。Ls.莴苣Lactucasativa；Tk.橡胶草Taraxacumkok-saghyz；Ha.向日葵Helianthusannuus；Rv.萝芙木Rauvolfiaverticillata；Of.桂花Osmanthusfragrans；Ir.碎米桠Isodonrubescens；Pv.夏枯草Prunellavulgaris；Cs.茶Camelliasinensis；Ma.桑树Morusalba；Zj.枣Ziziphusjujuba；Bo.红木Bixaorellana；Hb.橡胶树Heveabrasiliensis；Me.木薯Manihotesculenta；At.拟南芥Arabidopsisthaliana；Pk.思茅松Pinuskesiya；Tc.红豆杉Taxuschinensis；Zm.玉米Zeamays；Bp.绿藻Bathycoccusprasinos；Ol.鞭毛藻Ostreococcuslucimarinus；Gs.硫还原地杆菌Geobactersulfurreducens；Ma.桑树Morusalba；Zj.枣Ziziphusjujuba；Ap.相思子Abrusprecatorius；Ps.罂粟Papaversomniferum；Eu.杜仲Eucommiaulmoides；Vv.葡萄Vitisvinifera；Ca.小粒咖啡Coffeaarabica；Sm.丹参Salviamiltiorrhiza；Of.桂花Osmanthusfragrans；Nt.烟草Nicotianatabacum；Sl.番茄Solanumlycopersicum；Lh.菰腺忍冬Lonicerahypoglauca；Aa.黄花蒿Artemisiaannua；Ao.石刁柏Asparagusofficinalis；Zm.玉米Zeamays；Gb.银杏Ginkgobiloba；Gs.红藻Galdieriasulphuraria；Es.长囊水云Ectocarpussiliculosus；Ab.鲍曼不动杆菌Acinetobacterbaumannii；Ec.大肠杆菌Escherichiacoli。

3.3 PgMCT和PgCMK原核表达载体构建及诱导表达 将重组质粒pET-32a-PgMCT、pET-28a-PgCMK转化至大肠杆菌Transetta(DE3)中，经过菌液PCR及公司测序验证，得到阳性菌株。以pET-32a和pET-28a转入大肠杆菌Transetta(DE3)感受态细胞作为对照，观察重组融合蛋白pET-32a-PgMCT和pET-28a-PgCMK经过IPTG诱导后的蛋白表达情况，SDS-PAGE电泳结果显示(图6)，pET-32a-PgMCT和pET-28a-PgCMK在大肠杆菌Transetta(DE3)中，全菌和沉淀中均有目的基因的表达，分别在55、50 kDa出现条带，与预测结果一致，而上清液中均没有目的基因的表达，沉淀中出现目的蛋白，表明两种蛋白是以包涵体形式存在。

注：M为 Marker，A1为pET-32a空载，A2为未诱导的pET-32a-PgMCT菌株，A3为IPTG诱导的pET-32a-PgMCT菌株，A4为IPTG诱导的pET-32a-PgMCT上清液，A5为IPTG诱导的pET-32a-PgMCT沉淀，B1为pET-28a空载，B2为未诱导的pET-28a-PgCMK菌株，B3为IPTG诱导的pET-28a-PgCMK菌株，B4为IPTG诱导的pET-28a-PgCMK上清液，B5为IPTG诱导的pET-32a-PgCMK沉淀。图6 PgMCT(A)和PgCMK(B)重组蛋白原核表达

4 讨论

桔梗是传统的药食两用中药材品种之一[25]，其主要成分为结构和功能多样的萜类化合物，是由共同的结构前体物质IPP与DMAPP合成[26]，这2种前体的生物合成途径包括细胞质中的MVA途径和质体中MEP途径[16]。近年来，MEP途径是植物次生代谢调控研究的热点领域，MCT和CMK是MEP途径中的关键酶。

目前，MCT和CMK基因已经从多种不同植物中成功克隆，并验证其蛋白功能。简东琴等[23]从南方红豆杉中克隆了TcMCT基因的cDNA序列全长，研究发现TcMCT基因在绿色树皮中的表达量最高，并在大肠杆菌中超表达，验证TcMCT基因可促进β-胡萝卜素大量积累，证实MCT基因对于萜类物质的生物合成的重要性。本研究生物信息学分析表明PgMCT属于糖基转移酶GT-A超家族，与青蒿MCT[27]结构域预测结果一致，推测为非跨膜蛋白。PgMCT与其他植物的MCT进行同源性比对，表明不同植物MCT蛋白的N端氨基酸序列保守性较差，保守区主要集中在中部和尾部，均具有底物CTP结合位点和底物MEP结合位点。王学勇等[28]从丹参毛状根中克隆SmCMK基因的全长cDNA序列，初步验证茉莉酸甲酯诱导下SmCMK基因表达量与丹参酮类成分的积累呈正比关系。本研究预测PgCMK属于IspE超家族，与雷公藤[29]结构域预测结果一致，推测为非跨膜蛋白。PgCMK与其他植物的CMK进行同源性比对，表明不同植物的CMK蛋白均具有三个典型结合域Motif A、Motif B和Motif C，其中，Motif A是底物的结合位点；Motif B富含甘氨酸，是ATP结合位点和活性位点；Motif C是稳定Motif A和Motif B两个位点的保守区域，发挥稳定蛋白的作用。

大肠杆菌原核表达系统是目前应用最广泛的制备多克隆抗体的外源蛋白表达系统，具有菌种遗传背景和生化特性清楚、培养条件简单、成本低及周期短等特点[30-31]。在大肠杆菌中，外源基因的表达受很多因子的影响，包括目的基因结构的特性、温度、IPTG浓度、pH值和时间等[32]。本研究构建表达载体pET-32a-PgMCT、pET-28a-PgCMK，分别在0.8、0.4 mmol/L IPTG的诱导下，28 ℃培养12 h后，在大肠杆菌Transetta(DE3)中正确表达，且有较高的表达量，以包涵体的形式存在。包涵体蛋白一般没有生物活性，但其形成是宿主细胞对于外源有害蛋白高效表达的一种保护机制，可以增加蛋白质结构的稳定性，有利于减少表达蛋白的降解[33]。同时，包涵体中杂蛋白的含量较少，经过简单的分离与纯化，可以得到纯度较高的目的蛋白[34]。

本研究从桔梗中首次克隆得到了PgMCT和PgCMK基因，其ORF全长分别为954、1 227 bp，推测分别编码317、408个氨基酸，均为不稳定蛋白。构建了重组质粒pET-32a-PgMCT和pET-28a-PgCMK，转化至大肠杆菌Transetta(DE3)中诱导蛋白表达，结果显示PgMCT和PgCMK在大肠杆菌中表达量较高，以包涵体形式存在。下一步研究可以通过包涵体溶解与复性的方式，获得有活性的PgMCT和PgCMK蛋白，研究其体外酶学特征，为功能鉴定提供物质基础。MEP途径参与桔梗三萜皂苷的生物合成，该途径中多个基因的表达量对萜类化合物产量具有决定性影响，因此对桔梗MEP途径中关键酶基因的研究，为桔梗三萜皂苷成分的生物合成奠定了物质基础。