一测多评法同时测定甘草泻心汤中8种成分

唐红梅， 翟少钦， 陈春林， 闫志强， 朱买勋

(重庆市畜牧科学院，重庆 402460)

甘草泻心汤始载于《伤寒论》，属于国家中医药管理局发布的《古代经典名方目录(第一批)》药方之一[1]，组方药材炙甘草、黄芩、黄连、干姜、半夏(洗)、大枣，具有益气和胃、消痞止呕之功效[2]，常用于治疗急慢性胃肠炎症[3]、白塞氏综合症等[4]，临床疗效显著。在质量控制方面，张天一[5]建立黄连、黄芩指纹图谱，曹泽峰[6]采用HPLC法测定甘草苷、黄芩苷含量，但均难以满足多成分同时检测的要求，无法从整体上反映甘草泻心汤质量。

中药复方组成复杂，全面评价其质量应兼具有效成分的数量和含量，但这不仅造成检测成本增加，同时也会导致操作繁琐，效率低下。一测多评法不仅能高效准确地同时检测多种成分含量，还可降低实验成本和操作难度，克服对照品紧缺或价格昂贵的问题，尤其适合解决难以全面控制中药复方品质的难题[7-8]。因此，本实验建立一测多评法同时测定甘草泻心汤中姜酮、盐酸黄连碱、甘草素、盐酸小檗碱、汉黄芩苷、黄芩素、6-姜辣素、甘草酸铵的含量，以期为该方质量控制标准的建立奠定基础。

1 材料

1.1 仪器 Agilent 1260高效液相色谱仪(美国Agilent公司)；Waters e2695高效液相色谱仪(美国Waters公司)；SB25-12D数控超声波提取仪(宁波新芝生物科技有限公司)；AUW220D电子分析天平(日本岛津公司)。

1.2 试剂与药物 姜酮(批号110807-201802，纯度≥99.9%)、盐酸黄连碱(批号112026-201802，纯度≥94.0%)、盐酸小檗碱(批号110713-201212，纯度≥86.7%)、汉黄芩苷(批号112002-201702，纯度≥98.5%)、黄芩素(批号111595-201808，纯度≥97.9%)、甘草酸铵(批号110731-202021，纯度≥96.2%)对照品均购于中国食品药品检定研究院；甘草素(批号PS010083，纯度≥98.0%)、6-姜辣素(批号PS012566，纯度≥99.9%)对照品均购于成都普思生物科技股份有限公司。甘草泻心汤(100 mL/瓶，批号20210322、20210329、20210430、20210513、20210603、20210701)及对应的阴性样品均由重庆市畜牧科学院兽医兽药研究所中兽药制剂室提供。甲醇、乙腈、三氟乙酸为色谱纯，均购于上海麦克林生化科技有限公司；其他试剂均为分析纯；水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 Sepax HP-C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相0.1%三氟乙酸(A)-[甲醇-乙腈(1∶1)](B)，梯度洗脱，程序见表1；体积流量0.8 mL/min；柱温25 ℃；检测波长282 nm；进样量10 μL。

表1 梯度洗脱程序

2.2 溶液制备

2.2.1 对照品溶液 精密称取姜酮、盐酸黄连碱、甘草素、盐酸小檗碱、汉黄芩苷、黄芩素、6-姜辣素、甘草酸铵对照品适量，50%甲醇稀释定容，制成质量浓度分别为2.064 4、1.662 4、1.906 0、1.752 0、1.977 8、2.272 2、1.862 4、1.004 4 mg/mL的贮备液，精密量取适量，50%甲醇稀释定容，即得(各成分质量浓度分别为0.516 1、0.415 6、0.476 5、0.438 0、0.494 5、0.568 1、0.465 6、0.251 1 mg/mL)。

2.2.2 供试品溶液 精密量取本品20 mL，加入20 mL甲醇-乙腈(1∶1)混合溶液提取，12 000 r/min离心5 min，取上清液20 mL，挥去溶剂，50%甲醇溶解定容至5 mL，0.45 μm微孔滤膜过滤，即得。

2.2.3 阴性样品溶液 按照处方及工艺分别制备缺甘草、缺黄芩、缺黄连、缺干姜的阴性样品，按“2.2.2”项下方法制备，即得。

2.3 方法学考察

2.3.1 专属性试验 精密量取对照品、供试品、阴性样品溶液适量，在“2.1”项色谱条件下进样测定，结果见图1。由此可知，各成分分离情况理想(分离度均大于1.5)，理论塔板数均不低于5 000，表明该方法专属性良好。

1.姜酮 2.盐酸黄连碱 3.甘草素 4.盐酸小檗碱 5.汉黄芩苷 6.黄芩素 7.6-姜辣素 8.甘草酸铵1. vanillylacetone 2. coptisine hydrochloride 3.liquiritigenin 4. berberine hydrochloride 5. wogonoside 6. baicalein7.6-gingerol 8. ammonium glycyrrhizinate图1 各成分HPLC色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

2.3.2 线性关系考察 精密量取“2.2.1”项下贮备液0.05、0.10、0.25、0.40、0.50、0.75、1.00 mL，50%甲醇稀释定容至10 mL，制成7个质量浓度，在“2.1”项色谱条件下各进样10 μL测定。以对照品质量浓度为横坐标(X)，峰面积为纵坐标(Y)进行回归，结果见表2，可知各成分在各自范围内线性关系良好。

表2 各成分线性关系

2.3.3 精密度试验 取“2.2.1”项下对照品溶液，在“2.1”项色谱条件下进样测定6次，每次10 μL，测得姜酮、盐酸黄连碱、甘草素、盐酸小檗碱、汉黄芩苷、黄芩素、6-姜辣素、甘草酸铵峰面积RSD分别为0.24%、0.37%、0.36%、0.36%、0.34%、0.36%、0.86%、1.02%，表明仪器精密度良好。

2.3.4 重复性试验 取同一批本品(批号20210701)，按“2.2.2”项下方法平行制备6份供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下进样测定，测得姜酮、盐酸黄连碱、甘草素、盐酸小檗碱、汉黄芩苷、黄芩素、6-姜辣素、甘草酸铵峰面积RSD分别为1.78%、1.45%、1.72%、0.73%、0.62%、1.73%、1.81%、1.62%，表明该方法重复性良好。

2.3.5 稳定性试验 取同一批本品(批号20210701)，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，于0、2、4、6、8、10、12 h在“2.1”项色谱条件下进样测定，测得姜酮、盐酸黄连碱、甘草素、盐酸小檗碱、汉黄芩苷、黄芩素、6-姜辣素、甘草酸铵峰面积RSD分别为1.56%、1.48%、1.51%、0.86%、0.58%、1.57%、0.92%、1.87%，表明溶液在12 h内稳定性良好。

2.3.6 加样回收率试验 精密量取6份各成分含量已知的本品(批号20210701，姜酮、盐酸黄连碱、甘草素、盐酸小檗碱、汉黄芩苷、黄芩素、6-姜辣素、甘草酸铵质量浓度分别为0.241 3、0.311 8、0.566 9、0.131 9、0.666 4、0.127 9、0.114 3、0.288 5 mg/mL)10 mL，按100%水平加入适量对照品，按“2.2.2”项下方法平行制备6份供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下进样测定，计算回收率。结果，姜酮、盐酸黄连碱、甘草素、盐酸小檗碱、汉黄芩苷、黄芩素、6-姜辣素、甘草酸铵平均加样回收率分别为102.87%、101.86%、98.65%、99.22%、104.17%、101.28%、98.79%、98.47%，RSD分别为1.26%、1.49%、1.27%、1.32%、0.94%、1.48%、1.15%、1.32%。

2.4 相对校正因子 分别精密量取“2.2.1”项下贮备液0.05、0.10、0.25、0.40、0.50、0.75、1.00 mL，50%甲醇稀释定容至10 mL，制成7个质量浓度(编号1～7)，在“2.1”项色谱条件下各进样10 μL测定，以盐酸小檗碱为内标，采用多点校正法[9-11]计算其他7种成分的相对校正因子fk/s，公式为fk/s=fk/fs=(CkAs)/(CsAk)，其中Ck为其他成分含量，Ak为其他成分峰面积，Cs为内标含量，As为内标峰面积，结果见表3。

表3 各成分相对校正因子

2.5 耐用性考察

2.5.1 仪器、色谱柱 取“2.2.1”项下对照品溶液，考察Agilent 1260、Waters e2695色谱仪及Agilent ZORBAX SB-C18(4.6 mm×150 mm，5 μm)、Sepax HP-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)、Sepax GP-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)色谱柱对相对校正因子的影响，结果见表4，可知均无明显影响(RSD<5%)。

表4 不同仪器、色谱柱对相对校正因子的影响

2.5.2 体积流量 取“2.2.1”项下对照品溶液，在Agilent 1260色谱仪、Sepax HP-C18色谱柱下考察体积流量0.8、1.0、1.2 mL/min对相对校正因子的影响，结果见表5，可知均无明显影响(RSD<5%)。

表5 不同体积流量对相对校正因子的影响

2.5.3 柱温 取“2.2.1”项下对照品溶液，在Agilent 1260色谱仪、Sepax HP-C18色谱柱下考察柱温对相对校正因子的影响，结果见表6，可知均无明显影响(RSD<5%)。

表6 不同柱温对相对校正因子的影响

2.6 色谱峰定位 在Agilent 1260、Waters e2695色谱仪下考察了Agilent ZORBAX SB-C18、Sepax HP-C18、Sepax GP-C18色谱柱中各成分相对保留时间tRi/s，计算公式为tRi/s=tRi/tRs，其中tRi为待测物保留时间，tRs为内标保留时间[9-11]，结果见表7，可知均无明显影响(RSD<5%)。

表7 各成分相对保留时间

2.7 样品含量测定 取6批样品(批号分别为20210322、20210329、20210430、20210513、20210603、20210701)，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下进样测定，分别采用外标法和一测多评法计算含量，结果见表8，可知2种方法所得结果接近，相对平均偏差(RAD)均小于2.0%。

表8 各成分含量测定结果(mg/mL，n=3)

3 讨论

3.1 色谱条件选择 8种成分在190～300 nm波长处有较好的吸收，而且在196、282 nm处较强，但196 nm处易与溶剂峰混合，会对成分检测造成不良影响，故确定检测波长为282 nm。在色谱分离实验中发现，梯度洗脱对各成分的分离效果明显优于等度洗脱。甲醇选择性弱于乙腈，但前者溶剂峰形更优，故选择甲醇-乙腈(1∶1)作为流动相中的有机相，有利于各成分出峰；比较不同比例磷酸、甲酸、乙酸、三氟乙酸的色谱效果，发现0.1%三氟乙酸作为流动相中的水相时各成分出峰时间合适，峰形无拖尾，对称性较好。另外，在体积流量0.8 mL/min、柱温25 ℃、进样量10 μL时，各成分色谱峰分离度良好，峰形理想。

3.2 检测指标、内标选择 甘草泻心汤中以甘草、黄芩、黄连、干姜为主药，大枣、半夏为辅药[12]，但辅药所含成分色谱峰吸收度较差，故本实验未对其进行检测；甘草主要含有甘草素、甘草酸铵等成分[13]，黄芩主要含有汉黄芩苷、黄芩素等成分[14]，黄连主要含有盐酸小檗碱、盐酸黄连碱等成分[15]，干姜主要含有姜酮、6-姜辣素等成分[16]，这8个化合物在对应药理活性的起效机制中均存在直接关联，故选择其作为检测指标。另外，盐酸小檗碱化学性质稳定，容易获得，色谱峰吸收度好，具有代表性[17-19]，故选择其作为内标。

4 结论

本实验首次建立一测多评法同时测定甘草泻心汤中姜酮、盐酸黄连碱、甘草素、盐酸小檗碱、汉黄芩苷、黄芩素、6-姜辣素、甘草酸铵的含量，该方法操作简便，准确可靠，所得结果与外标法接近，可用于该方的质量控制。