两种方法检测结核分枝杆菌利福平耐药性比较

姚银钗，梁启德，蒋敏

广州市胸科医院检验科，广东广州 510095

结核病是感染结核分枝杆菌导致的一类慢性传染病，而肺结核属于结核病中一种最常见类型，主要症状是呼吸系统功能异常[1]。 近些年来，耐药结核病的患病率不断升高，尤其是广泛耐药结核病（XDRTB)发病率日益增加，有临床治愈率较低及病死率较高等特点，使结核病控制难度进一步提升。 因此，结核病、 耐药结核实验室检查及诊断对防治结核病有重要意义。 与培养法等传统检测方式相比，Gene Xpert MTB 有检测速度快、 灵敏度高和特异度高等优点，能协助临床更好地选取合理治疗方案，同时避免耐药菌株传播，被推荐为耐药结核筛查首选方式[2]，而PCR 熔解曲线属于近年来出现的一类新型耐药结核分子检测技术[3]。 当前，有关二者对耐药结核的检测对比研究较少。 为此， 该文选取2020 年8—12 月该院就诊的151 例肺结核患者为研究对象， 就PCR 熔解曲线与Gene Xpert MTB 两种方法在结核分枝杆菌利福平耐药性检测中的效果开展对比分析，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集该院肺结核患者151 例的痰液标本， 其中男97 例，女54 例；年龄13～87 岁，平均（49.25±8.76）岁；同时收集该院其他呼吸道疾病患者（明确诊断非肺结核患者， 未排除陈旧肺结核患者）20 例的痰液标本，其中男12 例，女8 例；年龄28～96 岁，平均（50.06±7.84）岁。两组患者一般资料对比差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。 纳入标准：①肺结核患者依据《临床诊疗指南》（结核病分册）[4]中有关诊断标准确诊； ②认知能力正常， 可配合完成此次研究。 排除标准：①存在认知障碍或者严重神经、精神疾病者；②拒绝或者中途退出此次研究者；③无完整临床资料者。

1.2 方法

1.2.1 仪器和试剂 Gene Xpert MTB 检测系统和试剂盒为美国Cepheid 公司生产；全自动SLAN-96 医用PCR 分析系统由上海宏石医疗科技有限公司生产；Lab-Aid824 核酸提取仪由厦门百维信生物科技有限公司生产；结核分枝杆菌利福平耐药基因突变检测试剂盒购自厦门致善生物科技有限公司； 磁珠法核酸提取试剂由厦门致善生物科技有限公司生产。

1.2.2 检测方法 （1）Gene Xpert MTB：将患者的痰液标本加入到2 倍体积液化工作液中， 进行30 s 的振荡混匀，后于室温内放置15 min，等样本全部液化之后， 采取无菌吸管将其中2 mL 取出后加入至Cartridge 反应盒中，后经Gene Xpert MTB 检测系统开展检测，严格依据说明书中内容开展操作，等到2 h左右后仪器能自动得出检测结果。

（2）PCR 熔解曲线：①结核分枝杆菌有关复合体迅速检测：将患者的痰液标本加入到2 倍体积工作液内，进行长达30 s 振荡混匀，后在室温中放置15 min，等到全部液化之后，选择1.5 mL 的样本转移到已经标记过的2.0 mL 管内， 通过13 000 r/min 速度开展5 min 离心处理， 将上清液弃去； 后加入300 μl 的TB-DNA 裂解液到含沉淀离心管内， 进行充分振荡混匀，以99°C 温度进行10 min 加热，后依据自动核酸提取试剂盒中说明书内容进行结核分枝杆菌的DNA 提取。 ②结核分枝杆菌有关耐药突变检测：依据PCR 熔解曲线结核分枝杆菌有关检测耐药突变试剂盒中说明书开展操作， 具体如下： 选取样本量（n）×19.6 μl 利福平PCR MIX A 与n×0.4 μl TB 酶混合溶液加入至1.5 mL 的离心管内，进行充分振荡混匀，后进行瞬时离心处理；另外选取n×19.6 μl 利福平PCR Mix B 与n×0.4 μl TB 酶混合溶液加进1.5 mL 的离心管内，进行充分振荡混匀，瞬时离心处理，同时以每管20 μl 依次分装在实时PCR 仪附带PCR反应管内，经微量加液器往每支分装好PCR 反应管内依次加进提取样品与阴性和阳性对照各有5 μl，盖严管盖。 充分混匀后瞬时离心，后转移PCR 反应管到PCR 扩增区，放到SLAN-96 PCR 仪器内。 PCR的熔解反应程序和上述相同，保存后运行。

1.3 观察指标

分析PCR 熔解曲线与Gene Xpert MTB 在检测结核分枝杆菌中的符合率， 同时将BD 快速药敏作为金标准， 统计两种检测方式对结核分枝杆菌利福平耐药性的检测准确度、敏感度及特异度情况。准确度=（真阳性+真阴性）/总数×100.00%； 特异性=真阴性/（真阴性+假阳性）×100.00%、灵敏性=真阳性/（真阳性+假阴性）×100.00%[5]。

1.4 统计方法

采用SPSS 23.0 统计学软件分析处理数据，计数资料采用频数和百分比(%)表示，采取χ2检验，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 151 例肺结核患者两种检测方式的结核分枝杆菌检测结果

151 例肺结核患者经Gene Xpert MTB 法显示结核分枝杆菌阳性140 例， 阳性率92.72%（140/151）；PCR 熔解曲线法显示阳性141 例， 阳性率93.38%（141/151）。 经两种方法检测结果均呈阳性共138例，均呈阴性共8 例，符合率96.69%（146/151）。 20例其他呼吸道病患者中2 例经Gene Xpert MTB 法检测显示为阴性， 经PCR 熔解曲线法显示为阳性，见表1、表2。

表1 151 例肺结核患者两种检测方式的结核分枝杆菌检测结果

表2 20 例其他呼吸道病患者两种检测方式的结核分枝杆菌检测结果

2.2 两种方式结核分枝杆菌均为阳性的138 例患者痰液标本内利福平耐药状况分析

经BD 快速药敏检出利福平耐药阳性22 例，阴性116 例；经PCR 熔解曲线法检测利福平耐药阳性21 例，阴性117 例；经Gene Xpert MTB 法检出利福平耐药阳性20 例，阴性118 例，见表3、表4。

表3 PCR 熔解曲线法检测利福平耐药的结果分析

表4 Gene Xpert MTB 法检测利福平耐药的结果分析

2.3 两种检测方式对利福平耐药的检测效能对比

PCR 熔解曲线法、Gene Xpert MTB 法对利福平耐药的检测准确度、 敏感度及特异度比较差异无统计学意义（P＞0.05），见表5。

表5 两种检测方式对利福平耐药的检测效能对比（%）

3 讨论

耐药性肺结核特别是广泛耐药肺结核、 耐多药肺结核属于结核病防治工作中的主要障碍。 有调查显示，于国内有近5.7%的新发肺结核患者及25.6%的治疗后肺结核患者伴随耐多药现象[6]。 正确、迅速结核分枝杆菌有关药敏检测技术属于早期观察到耐药患者的重要保证， 能为后续临床治疗工作开展起到重要的指导作用，提升耐药患者的治愈率，避免耐药结核流行。

痰培养和药敏试验虽是当前结核病、 耐药结核病的诊断金标准， 但受阳性检出率较低和实验周期较长等因素影响，无法及时给临床诊疗提供信息，进而会影响到结核病诊疗效果和耐药结核病防治[7]。近年来，伴随各类分子生物学有关技术进步，结核分枝杆菌有关耐药基因检测新型方法逐渐被普及到临床。 Gene Xpert MTB 属于美国Cepheid 公司所研发的一类能迅速检测结核分枝杆菌和利福平耐药性的手段，可弥补以往检测方式耗时过长等缺陷，其将巢式PCR 和荧光PCR 相结合， 将利福平耐药有关rpoB 基因当作靶基因， 结合rpoB 耐药决定其81bp范围中序列对5 对探针开展设计， 并对不同荧光基团开展标记，后MTB 野生株可于5 个探针相对应的位置扩增得到S 型曲线， 而突变株经扩增无法得到1 条或多条曲线， 因此能于2 h 内对MTB 及RIF 耐药一同开展检测[8-10]。 巢式PCR 应用能提升敏感性2～3 个数量级，对于原始产物分析能得到一致性、高质量产物累积，使得非特异扩增减少[11]。PCR 熔解曲线法属于近年来新出现的一类分子诊断技术， 能经识别出结核分枝杆菌的特异基因rpoB 基因、eis 基因 启 动 子 区、KatG315 和inhA94 密 码 子、ahpC 和inhA 启动子区、rrs 基因和gyr4 基因的突变位点以获取利福平等抗结核药耐药信息[12-14]。

赖惠英等[15]比较Gene Xpert MTB、PCR 熔解曲线在检测利福平耐药中的效果，最终发现，两种检测方法的准确度、敏感度及特异度相当，其中，PCR 熔解曲线法对利福平耐药的检测准确度、敏感度及特异度是97.90%、93.85、97.90%，与Gene Xpert MTB 法的准确度、敏感度及特异度96.90%、93.80%。 100.00%比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。 该次研究发现，PCR 熔解曲线法对利福平耐药的检测准确度、 敏感度及特异度是99.28%、95.45%、100.00%与Gene Xpert MTB 法的98.55%、90.91%、100.00%差异无统计学意义（P＞0.05），这和赖惠英等研究结果一致，说明两种方式在利福平耐药检测中均有重要价值。 但存在差异的是该研究未对福喹诺酮、 异烟肼和二线类注射药的药敏结果开展分析， 还需在未来研究中进一步完善。

综上所述，Gene Xpert MTB、PCR 熔解曲线法均能安全、准确、迅速应用到结核病和结核分支杆菌的利福平耐药检测中，对早期发现、诊断和治疗耐药结核病有重要意义。