几种传统发酵豆豉细菌多样性分析

于士军，江 隆，柴新义，徐馨怡，涂真真

（滁州学院 生物与食品工程学院，安徽 滁州 239000）

豆豉是我国传统特色豆制品调味料，营养丰富，药食兼用。豆豉是以黑豆或大豆为主要原料，在微生物发酵大豆蛋白达到一定程度时，加入盐、酒或者采取干燥等方法降低酶活性、延缓发酵过程而制成。豆豉种类繁多，根据发酵微生物不同，分为细菌型豆豉、曲霉型豆豉、毛霉型豆豉、根霉型豆豉、脉孢菌类豆豉五种[1]。从古至今，豆豉在我国人民的饮食文化和医疗保健中发挥着重要作用，其特殊的制作工艺体现了学界对我国古代科学技术的继承和发展[2]。

利用微生物在适宜的养分、温度和湿度等条件下自然发酵是传统豆豉最常用的生产方法。在不同地域，主要发酵微生物也不同，形成了由优势微生物（如米曲霉或毛霉）主导的微生物群落，并赋予了各地豆豉独特的风味、色泽、形态及益生功能[3]。近年来，国内学者对传统发酵豆豉微生物多样性、风味形成机理、理化特性和营养成分等进行了深入研究。郑多多等从云南地区传统发酵豆豉中分离出了枯草芽孢杆菌[4]；徐雪晗等从陇南地区的豆豉中发现了苯甲酰肼、丁酸乙酯、正戊醇等特有的挥发性成分[5]；冯霞等发现水豆豉具有较高的水分、较低的温度和酸度，有利于细菌生长[6]。研究发现，豆豉还含有可溶性蛋白氮、B族维生素以及多种生物酶等营养成分[7]。石聪等利用高通量测序技术分析了浏阳豆豉不同发酵阶段的微生物多样性，结果表明：在豆豉发酵15天时微生物OTU数显著增多[8]。李晓然等发现西双版纳的豆豉具有较高的微生物群落多样性，且嗜盐菌较多[9]。

本文以我国传统发酵豆豉为研究对象，利用高通量测序技术对4种不同地区的豆豉细菌群落结构多样性进行研究，探讨细菌多样性与豆豉品质之间的联系，为改善和提高传统发酵豆豉的品质提供理论依据，对促进传统发酵豆豉的科学生产和工业化进程具有重要的现实意义。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

材料：重庆永川豆豉（DC1)，重庆市永川豆豉食品有限公司；广东阳江豆豉（DC2），广东阳帆食品有限公司；江西湖口豆豉（DC3），九江石钟山豆制品有限公司；云南菌香豆豉（DC4），云南宏斌绿色食品集团有限公司。Fast DNASPIN Kit for Soil试剂盒（MP Biomedicals，USA）；亚铁氰化钾、氨水（25%）、对氨基苯磺酸、盐酸萘乙二胺、乙酸锌、盐酸、冰乙酸、铬酸钾、氢氧化钠、酚酞、硝酸、硝酸银等均为分析纯，亚硝酸钠溶液标准物（200μg/mL）、乙醇（纯度≥95%）、氯化钠（纯度≥99.8%）。

仪器：物性测试仪（TA.XT plus）、高速台式冷冻离心机（TGL-20M）、电泳仪（JY600C）、凝胶成像系统（GenoSens1850）、分析天平（BSA224S）、pH计（PHS-3E）、涡旋混合仪（XH-01N）、紫外可见分光光度计（UV-5100）。

1.2 理化指标分析

水分测定参照《食品中水分的测定》（GB5009.3-2016）的直接干燥法；亚硝酸盐测定参照《食品中亚硝酸盐与硝酸盐的测定》（GB5009.33-2016）的分光光度法；氯化物测定参照《食品中氯化物的测定》（GB5009.44-2016）的银量法。pH测定：称取3.00 g豆豉，加入27 mL去离子水，利用均质机高速搅拌匀浆（15 000 r/min），静置15 min，用pH计测定悬浮液pH值。使用TA.XT plus物性测试仪分析样品硬度、黏性、咀嚼性等（探头A/BE，测试速度1.0 mm/s，压缩形变量70%）。

1.3 MiSeq高通量测序

分别将10 g豆豉样品加入到40 mL无菌蒸馏水中，用拍击器拍打5 min，在4°C、5 000 r/min条件下离心5 min，取上清液分析。利用Fast DNASPIN Kit for Soil试剂盒提取细菌总DNA，使用紫外可见分光光度计检测DNA浓度，并根据D260/D280值判定DNA纯度。以总DNA为模板，选用细菌通用引物（5'-GTGCCAGCMGCCGCGG-3'，5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'）对细菌16S rRNAV4区进行扩增，然后利用Miseq平台进行高通量测序，每个样品重复3次。

1.4 数据分析

通过QIIME软件（v1.8.0，http://qiime.org/）对高通量测序结果进行修整、归并和划分，得到高质量OTU统计表，并计算Simpson、Chao1、ACE、Shannon多样性指数。在不同分类水平上（门、纲、目、科、属）生成4种豆豉的物种丰度表和物种分布图，并使用R软件对丰度前50位的菌属进行聚类分析和绘制热图。

2 结果与分析

2.1 理化分析结果

由表1可知，4种豆豉的水分含量存在显著差异，从大到小依次为：重庆永川豆豉、广东阳江豆豉、云南菌香豆豉、江西湖口豆豉；pH值从大到小依次为：江西湖口豆豉、云南菌香豆豉、广东阳江豆豉、重庆永川豆豉，其中，DC4和DC2的pH值差异不明显（P＞0.05）。豆豉pH值的高低会影响微生物生长，大多数细菌在pH 4～10的环境中均能生长，而放线菌适合在偏碱性环境下生长。4种豆豉的亚硝酸钠含量分别为1.44 mg/kg、1.18 mg/kg、1.05 mg/kg和0.91 mg/kg，均小于《食品添加剂使用标准》（GB 2760-2014）中规定的最大残留量30 mg/kg。4种豆豉的盐分均在（2.09～4.65 g/100 g）之间，其氯化钠含量从大到小依次为：重庆永川豆豉、广东阳江豆豉、云南菌香豆豉、江西湖口豆豉，低于豆酱（10.9 g/100 g）和火腿（8～10 g/100 g）等传统发酵食品。4种豆豉的硬度大小依次为：江西湖口豆豉、广东阳江豆豉、云南菌香豆豉、重庆永川豆豉。而黏性从大到小依次为：江西湖口豆豉、广东阳江豆豉、重庆永川豆豉、云南菌香豆豉。此外，咀嚼性从大到小依次为：江西湖口豆豉、广东阳江豆豉、重庆永川豆豉、云南菌香豆豉。经分析发现，江西湖口豆豉的硬度、黏性和咀嚼性均大于其余3种豆豉，可能与其低水分有关。

表1 不同豆豉的理化指标检测结果

2.2 序列长度分布

基于高通量测序，4种豆豉共获得代表序列211 335条，其中，重庆永川豆豉53 686条、广东阳江豆豉59 805条、江西湖口豆豉42 586条、云南菌香豆豉55 258条。

2.3 细菌群落多样性分析

在97%相似度下，利用QIIME软件分析4种豆豉的特征性OTU及其丰度信息（图1和表2）。由图1可知，4种豆豉的OUT数共有2 776个，其中，重庆永川豆豉、广东阳江豆豉、江西湖口豆豉、云南菌香豆豉分别有OTU数603、517、484和1 173个。4种豆豉共有的OTU数为30个，而DC1、DC2、DC3、DC4中特有的OTU数分别为244、214、314、752，其余OTU为部分豆豉之间共有。

表2 4种豆豉细菌OTU划分和分类水平统计表

图1 4种豆豉的细菌OTU分布维恩图（97%水平下）

由图2可知，在97%相似度下，重庆永川豆豉、广东阳江豆豉、江西湖口豆豉稀释曲线已达到饱和状态；云南菌香豆豉稀释曲线基本达到饱和状态，表明4种豆豉中大多数细菌物种信息均能被反映出来。

图2 4种豆豉的细菌OTU稀释曲线

4种豆豉的Simpson、Chao1、ACE和Shannon多样性指数如表3所示。可知，4种豆豉的细菌群落丰富度从大到小依次为：云南菌香豆豉、重庆永川豆豉、广东阳江豆豉、江西湖口豆豉。江西湖口豆豉的细菌群落多样性最高（6.90），广东阳江豆豉的细菌群落多样性最低（4.20），多样性从大到小依次为：江西湖口豆豉、云南菌香豆豉、重庆永川豆豉、广东阳江豆豉。

表3 4种豆豉细菌多样性指数表

2.4 细菌群落结构分析

2.4.1 门水平的优势菌群分布特征

4种豆豉细菌群落组成在门水平上的分布如图3所示，主要有厚壁菌门（Firmicutes，60.62%±37.77%）、变形菌门（Proteobacteria，21.00%±18.11%）、蓝细菌门（Cyanobacteria，10.13%±18.53%）。不同区域豆豉优势细菌相对丰度存在差异，其中，广东阳江豆豉的厚壁菌门丰度最高（91.7%），其次是重庆永川豆豉（74.0%）、江西湖口豆豉（71.1%），最低的是云南菌香豆豉（5.6%）；变形菌门丰度最高的是云南菌香豆豉（46.4%），其次是重庆永川豆豉（20.0%）和江西湖口豆豉（13.5%），最低的是广东阳江豆豉（4.2%）；而蓝细菌门丰度最高的是云南菌香豆豉（37.9%），其次是重庆永川豆豉（2.0%）和广东阳江豆豉（0.5%），而江西湖口豆豉则不含此门类。结果表明，4种豆豉的优势菌群存在明显差异，重庆永川豆豉、广东阳江豆豉和江西湖口豆豉的优势菌群为厚壁菌门（Firmicutes），云南菌香豆豉为变形菌门（Proteobacteria）和蓝细菌门（Cyanobacteria）。

图3 4种豆豉的细菌群落结构及分布（门水平）

微生物是影响豆豉风味的重要因素[10]。4种豆豉的细菌群落结构存在一定相似性，优势菌主要集中在厚壁菌门（Firmicutes）、变形菌门（Proteobacteria）、蓝细菌门（Cyanobacteria），以及放线菌门（Actinobacteria）。厚壁菌门（Firmicutes）是一类革兰氏阳性菌，主要包括芽孢杆菌属（Bacillus）、葡萄球菌属（Staphylococcus）、乳酸杆菌属（Lactobacillus）、乳球菌属（Lactococcus）、明串珠菌属（Leuconostoc）等，其中，芽孢杆菌属（Bacillus）和巨型球菌属（Macrococcus）可耐受10%盐度和55°C高温，有利于豆豉在后熟阶段的发酵[11]。变形菌门（Proteobacteria）是一类革兰氏阴性菌，是细菌界中最大的一个门类[12]，其中Beta-变形菌纲的Massilia属具有脱氮作用，可将硝酸盐还原为氮气[13]，从而降低豆豉发酵过程中硝酸盐转化为亚硝酸盐的可能[14]。蓝细菌门（Cyanobacteria）是一类革兰氏阴性菌，适应环境能力强，能在低温、高碱等极端环境下生存[15]，其中，铜绿微囊藻（Microcystis aeruginosa）可降解糖原并产生CO2、乙醇和醋酸等物质[16]，若豆豉发酵过程中有该菌参与，可能会影响豆豉pH及酸味。此外，放线菌门（Actinobacteria）是一类革兰氏阳性菌，其中，马杜拉放线菌（Actinomadura sp.）是一种稀有放线菌，可产生高抗肿瘤活性的抗生素[17]，若存在于豆豉中则可提升其益生功能。

2.4.2 属水平的优势菌群分布特征

4种豆豉的细菌群落组成在属水平上存在明显差异（见图4），其中，重庆永川豆豉的优势菌属为芽孢杆菌属（Bacillus，52.07%），还存在食酸菌属（Acidovorax）。研究表明，芽孢杆菌（Bacillus）与豆豉的酸味呈正相关，与鲜味及咸味呈负相关，对豆豉滋味有影响[18]，而且枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）可使豆豉具有抗菌、溶血栓以及抗癌等功能[19]；食酸菌属（Acidovorax）是一类重要的三价砷氧化菌，可将三价砷氧化为五价砷[20]，从而降低豆豉砷的毒性。

图4 4种豆豉的细菌群落结构及分布（属水平）

广东阳江豆豉的优势菌属为四联球菌属（Tetragenococcus，67.77%）、乳酸杆菌属（Lactobacillus，10.43%）和芽孢杆菌属（Bacillus，7.73%），其中，嗜盐四联球菌（Tetragenococcus halophilus）是四联球菌属中最常见的一种细菌，在食品发酵过程中可提高有机酸、醛类和酯类等风味物质含量[21]；乳酸杆菌是一种有益菌，可产生乳酸、过氧化氢等抗菌物质来抑制致病菌[22]，能延长豆豉保藏期，还能产生醇、醛和酮等多种风味物质[23]，使豆豉既美味又有益于人体健康[24]。

江西湖口豆豉的优势菌属为葡萄球菌属（Staphylococcus，54.36%）、拟诺卡氏菌属（Nocardiopsis，10.63%）和芽孢杆菌属（Bacillus，10.62%）。葡萄球菌属是一种革兰氏阳性球菌，多数为非致病菌，少数可导致疾病，如金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）[25]，其中，木糖葡萄球菌和肉葡萄球菌可分解蛋白质和脂肪并提升食品风味[26]。拟诺卡氏菌属（Nocardiopsis）可代谢产生吲哚并咔唑类化合物，此类产物具有抗肿瘤、抗感染和抗过敏作用[27]，有利于豆豉益生功能的提升。

云南菌香豆豉的优势菌属为水茄属（Solanum torvum，31.21%）、假单胞菌属（Pseudomonas，4.97%）、劳尔氏菌属（Ralstonia，4.81%）。其中，水茄属（Solanum torvum）具有清热解毒、活血消肿、祛风利湿等功效，以及抗真菌、抗肿瘤等活性[28]；假单胞菌属分泌的酪氨酸酶可以催化酪氨酸合成L-3,4-二羟基苯丙氨酸，可用来预防和治疗帕金森综合征[29]。

此外，在江西湖口豆豉和云南菌香豆豉中还发现了一些致病菌，可能是其发酵或包装过程中受到了环境微生物的污染。例如，江西湖口豆豉中的变形杆菌（Proteus）是一种革兰氏阴性致腐菌，可引发食物中毒[30]，并引起如呼吸道感染[31]、肺炎[32]、肺结核[33]等多种感染性疾病。云南菌香豆豉中的不动杆菌（Acinetobacter）是一种革兰氏阴性病原菌，有较强的耐药性，例如，鲍曼不动杆菌能够引起肺炎、脑膜炎、组织感染等疾病[34]。

2.5 PCA主成分分析

基于属水平的4种豆豉微生物群落结构组成的PCA分析如图5所示。可知，4种豆豉之间的离散程度都较大，表明重庆永川豆豉、广东阳江豆豉、江西湖口豆豉和云南菌香豆豉之间细菌群落结构在属水平差异较大，相似度较低。

图5 4种豆豉的细菌群落结构PCA分析（属水平）

2.6 群落组成热图分析

对4种豆豉中丰度前50的菌属进行聚类分析，并绘制热图，如图6所示。可知，4种豆豉的细菌群落结构存在差异，且云南菌香豆豉细菌群落丰度最高，其次是重庆永川豆豉和江西湖口豆豉，而广东阳江豆豉最低。

图6 4种豆豉细菌群落组成热图（属水平）

3 结论

本研究以重庆永川豆豉、广东阳江豆豉、江西湖口豆豉和云南菌香豆豉等4个不同产地的传统发酵豆豉为对象，对豆豉的水分含量、pH值、氯化钠含量、亚硝酸盐含量、质构、细菌群落结构多样性等进行了详细研究。江西湖口豆豉的水分含量最低（16.18%），其硬度及咀嚼性最大。4种豆豉的盐分范围在2.09～4.65（g/100 g）之间，豆豉pH值分别为5.06、5.36、6.27、5.37。4种豆豉的细菌共属于28门、58纲、134目、221科、440属、633种，其优势菌属存在差异。不同产地豆豉的细菌多样性差异可能与使用原料、发酵工艺、发酵起始微生物等因素有关。芽孢杆菌对豆豉滋味有影响，乳酸杆菌、四联球菌和葡萄球菌对豆豉风味有影响，水茄属、拟诺卡氏菌和假单胞菌能提升豆豉益生功能。