基于GEO数据库探索口腔鳞状细胞癌淋巴转移的可能机制

【摘要】目的 探索口腔鳞状细胞癌发生早期淋巴转移与否的差异基因，并进一步分析其功能，以探索口腔鳞状细胞癌发生淋巴转移的可能机制。方法 从GEO数据库中下载GSE176221芯片数据，在R软件中利用Limma数据包筛选差异基因，使用clusterProfiler， org.Hs.eg.db， enrichplot和ggplot数据包进行差异基因的GO和KEGG分析，最后在STRING网站构建蛋白互作网络，在Cytoscape中筛选出关键差异基因。结果 通过分析，共筛选出218个差异基因。对差异基因进行GO分析发现差异基因主要调控神经元突触膜的合成和组装、络氨酸磷酸化的调控、内皮细胞的发育等生物过程;细胞组成富集主要包括远离基底膜的细胞部分、外侧细胞膜成分和AMPA谷氨酸受体复合;分子功能富集主要包括生长因子活性、NADPH酶活性、凝脂酰肌醇激酶活性、花生四烯酸加氧酶活性等。KEGG分析发现富集的细胞通路主要包括PI3K-AKT信号通路、胰岛素抵抗、TNF信号通路等。筛选出的5个关键基因分别是IL6， VEGFA， HSPA1A， NR4A2和UBC。结论 利用生物信息学筛选出口腔鳞状细胞癌发生早期淋巴转移与否的5个关键差异基因可能是其发生早期淋巴转移的关键机制，有望成为其治疗的靶点分子，为今后的研究提供新的思路。

【关键词】口腔鳞状细胞癌;淋巴转移;GEO数据库;生物信息学

基金项目：贵州省科技计划项目（黔科合基础-ZK[2021]一般433）

口腔鳞状细胞癌（oral squamous cell carcinoma， OSCC）是一种具有不同分化程度的具有侵袭性的肿瘤，倾向于早期、广泛的淋巴结转移，是口腔最常见的恶性肿瘤，约占口腔癌发病率的90%，且死亡率高，我国OSCC的死亡率约为1.26/10万。OSCC病灶周围器官血液供应和淋巴回流丰富，常发生早期转移，手术难度高并且复发可能性高。其中，淋巴结转移是OSCC转移的最主要途径，对手术切除愈合影响最显著。因此，探索OSCC早期淋巴转移的可能机制十分必要。

生物信息学是近年来兴起的一门新兴学科，重点研究基因组学和蛋白组学。本研究从GEO数据库中获取基因芯片数据，筛选出发生淋巴转移的OSCC和未发生淋巴转移的OSCC间差异基因，并进一步行基因本体论分析和基因组百科全书分析，最后构建蛋白互作网络，筛选出核心差异基因，从生物信息学角度出发探索哪些基因与OSCC发生淋巴转移密切相关，为后续探究OSCC早期淋巴转移的可能機制奠定基础。

1 资料与方法

1.1原始数据来源

本研究使用芯片来源与GEO数据库中的GSE176221芯片，平台文件为GPL20795平台文件。芯片包含9例OSCC数据信息，其中5例发生淋巴转移，4例未发生淋巴转移。

1.2差异基因分析

将未发生淋巴转移的芯片数据视为对照组，发生淋巴转移的芯片视为实验组，使用R软件读取基因芯片数据，使用limma数据包筛选差异基因，筛选条件为p<0.05，logFC>1，筛选出差异基因后立业pheatmap数据包绘制差异基因热图。

1.3GO和KEGG分析

使用R软件读取筛选出的差异基因，使用clusterProfiler， org.Hs.eg.db， enrichplot和ggplot数据包进行差异基因的GO和KEGG分析，以p<0.05作为筛选条件筛选出显著富及结果。

1.4蛋白互作网络构建

使用蛋白互助网络在线分析工具STRING构建差异基因蛋白互作网络，置信度阈值设为0.7。根据所得的蛋白互作网络，在Cytoscape中寻找网络中的关键基因。

2 结果

2.1 差异表达基因

在R软件中利用limma数据包筛选差异表达基因，共筛选出218个差异基因，将差异显著程度排名前50的基因绘制热图，其结果见图1。

2.2 差异基因的GO分析和KEGG分析

在R软件中，使用clusterProfiler， org.Hs.eg.db， enrichplot和ggplot数据包对218个差异基因进行GO分析和KEGG分析。

2.2.1 差异基因GO分析结果

以p<0.01作为条件筛选差异基因富集的GO条目，共筛选出76条GO条目，其中生物过程富集了62条，主要包括神经元突触膜的合成和组装、络氨酸磷酸化的调控、p38MAPK通路的正向调控、内皮细胞的发育等;细胞组成富集了4条，包括远离基底膜的细胞部分、外侧细胞膜成分和AMPA谷氨酸受体复合;，分子功能富集了10条，主要包括生长因子活性、NADPH酶活性、凝脂酰肌醇激酶活性、花生四烯酸加氧酶活性等。选择前5显著富集的条目并作柱状图，见图2。

2.2.2 差异基因KEGGE分析结果

以p<0.01作为条件筛选差异基因富集的KEGG条目，共筛选出10条KEGG通路，主要包括，PI3K-AKT信号通路、胰岛素抵抗、TNF信号通路等，见图3。

2.3 蛋白互作网络分析

在STRING在线网站对218个差异基因进行蛋白互作分析，将所得结果导入到Cytoscape软件中，得到蛋白互作网络图（见图4），并利用Cytoscape软件中的MCODE插件筛选Hub基因，共得到5个Hub基因（见图5）。

3 讨论

本研究通过挖掘GEO数据库，对比了口腔鳞状细胞癌发生淋巴转移和未发生淋巴转移的差异基因，共发现218个差异基因。进一步对差异基因进行了GO可KEGG分析。最后对差异基因绘制蛋白互相网络图，并筛选差异基因的Hub基因，共筛选出5个Hub基因，分别是：IL6， VEGFA， HSPA1A， NR4A2和UBC。

通过基于功能富集分析发现相较于未发生淋巴转移的口腔鳞状细胞癌，发生转移者差异基因的生物过程主要集中在神经元的发育和内皮细胞的发育，这与发生淋巴转移特性相符;细胞组成主要集中在细胞自身部分，包括远离基底膜的细胞膜部分、外侧细胞膜成分和AMPA谷氨酸受体复合等，分子功能则主要集中在生长因子活性、NADPH酶活性、凝脂酰肌醇激酶活性、花生四烯酸加氧酶活性等，与癌症发生淋巴转移特性相符。这说明本研究筛选的差异基因与口腔鳞癌发生淋巴转移密切相关。

本研究筛选出的5个Hub基因均与肿瘤转移密切相关。白细胞介素6（Interleukin-6， IL-6）是一串分子量为25kDa的糖基化多肽链，参与机体的免疫反应、炎症、造血、胚胎发育和其他的基础过程。有研究指出IL-6在大多数肿瘤中均高表达，如乳腺癌、前列腺癌、胰腺癌等，且与肿瘤的侵袭性生长和对治疗的反应密切相关。在口腔鳞状细胞癌方面，有研究证实血清IL-6浓度与其预后密切相关，甚至有研究者提出IL-6可作为口腔鳞状细胞癌治疗的靶点分子。血管内皮生长因子A（Vascular endothelial growth factor a， VEGFA）是血管内皮生长因子家族的一员，是促进肿瘤内血管生长的重要因子，与肿瘤的生长和转移密切相关。VEGFA在口腔鳞状细胞癌中高表达，且与其预后密切相关。热休克蛋白A1A（Head shock protein A1A， HSPA1A）是热休克蛋白的一员，参与肿瘤的生长、侵袭和癌变。HSPA1A在多种癌症组织中均有高表达，且有研究证实其高表达和卵巢上皮癌的预后密切相关。HSPA1A在口腔鳞状细胞癌中也高表达，且能提高鳞状癌细胞的恶性程度。核受体4A2（Nuclear receotor 4A2， NR4A2）是核受体亚家族成员之一，参与调控细胞周期、凋亡、脂质代谢、炎症、成血管化和癌变等过程。NR4A2在多数实体瘤中均有高表达，如胃腺癌、恶性胶质瘤和直肠癌等。泛素蛋白C（Ubiquitin C， UBC）是编码泛素蛋白的主要基因之一，在蛋白泛素化过程中起着至关重要的作用。UBC介导的泛素化参与细胞增殖、细胞周期和应急反应等。有研究发现UBC参与多种肿瘤的发生发展，如前列腺癌、膀胱癌和胃癌等。上述五个Hub基因在其他肿瘤中均有不同程度的研究，但在口腔鳞状细胞癌中HSPA1A， NR4A2和UBC所起的作用还不清楚，且上述五个基因在口腔鳞状细胞癌发生淋巴转移中的作用及机制还需进一步研究。由于此五个基因参与肿瘤的发生和发展，因此，本研究的结果可为口腔鳞状细胞癌的早期淋巴转移研究提供新的靶点分子研究思路。

本研究通過对数据库数据进行生物信息学的分析，筛选出口腔鳞状细胞癌发生早期淋巴转移与未发生淋巴转移的差异基因，并进一步对差异基因进行GO和KEGG分析，最后构建PPI网络，找到5个关键基因。虽然筛选的关键基因有部分在口腔鳞状细胞癌中的研究还不多，在其早期淋巴转移中的作用及机制还不清楚，但这给我们启示这些基因可能是口腔鳞状细胞癌发生早期淋巴转移的关键基因，未来可能是治疗的靶点，还需更多的实验来验证。

参考文献

[1]Di Pardo BJ，Bronson NW，Diggs BS，et al. The global burden of esophageal cancer： A disability-adjusted life-year approach[J].World J Surg，2016，40（2）： 395-401.

[2] 张陈平.口腔癌治疗规范的思考[J].中国肿瘤临床， 2010， 37（16）： 905-907

[3]Hafed L， Farag H， Shaker O， et al. Is human papilloma virus associated with salivary gland neoplasms？ An in situ-hybridization study[J]. Arch Oral Biol， 2012， 57（9）： 1194-1199.

[4]Li S， Sun YL， Gao DW. Role of the nervous system in cancer metastasis[J]. Oncol Lett， 2013， 5（4）： 1101-1111.

[5]Lee BS， Jang JY， Seo CR， et al. Crosstalk between head and neck cancer cells and lymphatic endothelial cells promotes tumor metastasis via CXCL5-CXCR2 signaling[J]. FASEB J， 2021， 35（1）： E1181.

[6]Kong Y， Li YT， Luo YM， et al. circNFIB1 inhibits lymphangiogenesis and lymphatic metastasis via the miR-486-5p/PIK3R1/VEGF-C axis in pancreatic cancer[J]. Mol Cancer， 2020， 19（1）： 82.

[7]Lin W， Jiang L， Chen YL， et al. Vascular endothelial growth factor-D promotes growth， lymphangiogenesis and lymphatic metastasis in gallbladder cancer[J]. Cancer Lett， 2021， 314（2）： 127-136.

[8]Hunter CA， Jones SA. IL-6 as a keystone cytokine in health and disease[J]. Nat Immunol， 2015， 16（5）： 448-457.

[9]Hasegawa H， Mizoguchi I， Chiba Y， et al. Expanding diversity in molecular structures and functions of the IL-6/IL-12 heterodimeric vytokine family[J]. Front Immunol， 2016， 7： 479.

[10]Dethlefsen C， Højfeldt G， Hojman P. The role of intratumoral and systemic IL-6 in breast cancer. Breast Cancer Res Treat[J]. 2013， 138（3）： 657-664.

[11]Culig Z， Puhr M. Interleukin-6： a multifunctional targetable cyto kine in human prostate cancer[J]. Mol Cell Endocrinol， 2012， 360（1-2）： 52-58.

[12]Miura T， Mitsunaga S， Ikeda M， et al. Characterization of patients with advanced pancreatic cancer and high serum interleukin-6 levels[J]. Pancreas， 2015， 44（5）： 756-763.

[13]Wu CT， Chen MF， Chen WC， et al. The role of IL-6 in the radiation response of prostate cancer. Radiat Oncol[J]. Radiat Oncol， 2013， 8： 159.

[14]Uzdan Uz， Gorken E. Association Between Interleukin-6 and head and neck squamous cell carcinoma： a systematic review[J]. Clin Exp Otorhinolaryngol， 2021， 14（1）： 50-60.

[15]Claessom-Welsh L， Welsh M. VEGFA and tumour angiogenesis[J]. J Intern Med， 2013， 273（2）： 114-127.

[16]Caroline BRSS， Marcilei ECB， Renata OdS， et al. Elevated VEGFA mRNA levels in oral squamous cell carcinomas and tumor margins： a preliminary study[J]. J Oral Pathol Med， 2016， 45（7）： 481-485.

[17]Peterle GT， Maia LL， Trivilin LO， et al. PAI-1， CAIX， and VEGFA expressions as prognosis markers in oral squamous cell carcinoma[J]. J Oral Pathol Med， 2018， 47（6）： 566-574.

[18]Nowak M， Glowacka E， Kielbik M， et al. Secretion of cytokines and heat shock protein （HspA1A） by ovarian cancer cells depending on the tumor type and stage of disease[J]. Cytokine， 2017， 89： 136-142.

[19]Andrade WPD， Braga LSC， Goncales NG， et al. HSPA1A， HSPA1L and TRAP1 heat shock genes may be associated with prognosis in ovarian epithelial cancer[J]. Oncol Lett， 2020， 19（1）： 359-367.

[20]Ludwig S， Sharma P， Wise P， et al. mRNA and miRNA profiles of exosomes from cultured tumor cells reveal biomarkers specific for HPV16-positive and HPV16-negative head and neck cancer[J]. Int J Mol Sci， 2020， 21（22）： 8570.

[21]Chen Q， Wu K， Qin X， et al. LASP1 promotes proliferation， metastasis， invasion in head and neck squamous cell carcinoma and through direct interaction with HSPA1A[J]. J Cell Mol Med， 2020， 24（2）： 1626-1639.

[22]Misund L， Selvik LKM， Norsett K， et al. NR4A2 is regulated by gastrin and influences cellular responses of gastric adenocarcinoma cells[J]. PloS One， 2013， 8（9）： E76234.

[23]Karki K， Li X， Jin UH， et al. Nuclear receptor 4A2 （NR4A2） is a druggable target for glioblastomas[J]. J Neurooncol， 2020， 146（1）： 25-29.

[24]Zagani R， Hamzaoui N， Cacheux W， et al. Cyclooxygenase-2 inhibitors down-regulate osteopontin and Nr4A2-new therapeutic targets for colorectal cancers[J]. Gastroenterology， 2009， 137（4）： 1358-1366.

[25]Zhang RC， Yang YJ， Huang HJ， et al. UBC mediated by SEPT6 inhibited the progression of prostate cancer[J]. Mediators Inflamm， 2021， 2021： 73939029.

[26]Castaneda， FA， Busquets CXR， Robles JM. Assessing the clinical benefit of UBC rapid in the surveillance and initial diagnosis of bladder cancer[J]. Clin Genitourin Cancer， 2020， 18（3）： 230-235.

[27]Scarpa ES， Tasini F， Crinelli R， et al. The ubiquitin gene expression pattern and sensitivity to UBB and UBC knockdown differentiate primary 23132/87 and metastatic MKN45 gastric cancer cells[J]. Int J Mol Sci， 2020， 21（15）： 5435.

作者簡介：陈河林（1990-），男，土家族，湖北恩施人，主治医师，博士，贵州医科大学附属口腔医院，种植牙和修复