1，3⁃二氯⁃2，4，6⁃三硝基苯纯度的高效液相色谱分析方法

刘云章，何佳远，肖 芸，陈丽珍，王建龙

（1. 中北大学化学工程与技术学院，山西 太原 030051；2. 湖北东方化工有限公司，湖北 襄阳 441404）

1 引言

1，3⁃二氯⁃2，4，6⁃三硝基苯（DCTNB）是一种浅黄色片状晶体，易溶于二氯甲烷等有机溶剂，但不溶于水［1］。由于硝基的影响，苯环上位于硝基邻位或对位的卤原子比较活泼，容易发生亲核取代反应，硝基越多，卤原子就越活泼。因此它是一种重要的含能化合物中间体，能够与卤代芳香硝基化合物发生Ullmann反应，生成具有较高熔点的多硝基联苯类耐热炸药，如二 氨 基 六 硝 基 联 苯（DIPAM）［2］、九 硝 基 三 联 苯（NONA）［3］等，还可与含有氨基的化合物进行偶联得到性能优异的含能化合物。

纯度是含能化合物中间体品质评价的重要指标之一，对后续合成各种含能化合物的品质会产生重大的影响。纯度的常用测试方法主要包括滴定法［4］、凝固点下降法［5］、差热分析法（DSC）［6］、核磁共振氢谱法（1H NMR）［7］和高效液相色谱法（HPLC）［8］等。HPLC因其样品用量少、灵敏度高、重现性好及自动化程度高等优势而广泛应用于含能化合物的纯度分析［9-13］，是含能化合物定性定量分析的重要方法之一。

近年来，关于DCTNB 的研究工作主要集中在合成工艺优化及晶体结构鉴定［14-16］，缺乏相应的纯度分析方法研究，不利于其合成过程的纯度检测与质量控制。 为此，本研究基于反相高效液相色谱法（RP⁃HPLC），对DCTNB 与其合成过程中产生的杂质（1，5⁃二氯⁃2，4⁃二硝基苯（DCDNB）和2，3，4⁃三氯⁃1，5⁃二硝基苯（TCDNB））进行分离，探究最优色谱条件，通过建立DCTNB 及其合成过程中杂质的高效液相色谱分析方法，为DCTNB 的纯度分析和质量控制提供可靠的参考。

2 实验部分

2.1 仪器与试剂

高效液相色谱仪（包括P1100 系列恒流泵A/B、GM1100 梯度混合器、D1100 紫外可见检测器、O1100 色谱柱恒温箱、Elitapex 色谱数据工作站），Agress1100 型，大连依利特分析仪器有限公司。色谱柱，Hypersil ODS2（250 mm×4.6 mm，5 μm），大连依利特分析仪器有限公司。电子天平，AL104 型，精确度0.0001 g，梅特勒—托利多集团。超声清洗仪，KQ5200M 型，东莞市科桥有限公司。紫外分光光度计，UV⁃2802S 型，尤尼柯（上海）仪器有限公司。

DCDNB，DCTNB 及TCDNB，分别在无水乙醇中多次重结晶，纯度均大于99.0%，实验室自制。无水乙醇，分析纯，纯度大于99.5%，国药集团化学试剂有限公司。甲醇（MeOH），色谱纯，纯度大于99.9%，萨恩化学技术（上海）有限公司。乙腈（ACN），色谱纯，纯度大于99.9%，萨恩化学技术（上海）有限公司。

2.2 样品的处理

准确称取20.00 mg 的DCTNB 粗品，置于100 mL的棕色容量瓶中，使用乙腈溶解样品并定容至容量瓶刻度线处，然后使用超声震荡使其完全溶解，配置成200 mg·L-1的标准样品溶液。准确称取25.00 mg 的DCTNB 纯 品，12.50 mg 的DCDNB 纯 品 及12.50 mg的TCDNB 纯品，分别加入到三个50 mL 的棕色容量瓶中，使用乙腈溶解样品并定容至容量瓶刻度线处，然后使用超声震荡使其完全溶解，配置成标准储备液；再分别对上述标准储备液进行稀释，配置成500，250，100，50，20，10，5 mg·L-1等不同浓度的标准工作溶液，用于标准工作曲线及检测限等相关研究。所有样品在进行HPLC 分析前，都经过孔径为0.45 μm 的尼龙66 过滤膜过滤，避光保存。

2.3 HPLC 方法的优化

以乙腈为溶剂，配制浓度约为10 mg·L-1的DCD⁃NB，DCTNB 及TCDNB 乙腈溶液，采用紫外可见分光光度计进行扫描，扫描波长范围设置为200～800 nm，得到三种化合物的最大紫外吸收波长，进而确定检测波长。HPLC 分析方法的研究主要在大连依利特Agress1100 高效液相色谱仪上进行，使用标准样品溶液进行高效液相色谱分析，对流动相体系及比例、流速、柱温及进样量等影响色谱分析的因素进行选择，确定最优色谱条件。HPLC 分析、数据采集及定量分析均在Elitapex 色谱数据工作站上进行。

2.4 HPLC 方法的验证

建立DCTNB 高效液相色谱分析方法的标准曲线，通过分析灵敏度、精密度、重复性及准确度等参数，对建立的HPLC 分析方法进行验证。

基于不同浓度的标准工作溶液来建立相应的标准工作曲线，以信噪比S/N=3 时的浓度为检出限（LOD）来分析该方法的检出限，以信噪比S/N=10 时的浓度为定量限（LOQ）来分析该方法的定量限，以此来评价该方法的灵敏度。

在最优色谱条件下，对样品溶液进行三次平行测定，间隔5 h 后对样品溶液再次进行三次平行测定，分析DCDNB，DCTNB 及TCDNB 的保留时间和峰面积等相关参量的相对标准偏差（RSD），评估该方法的精密度与重复性。

为验证方法的准确性，在未知浓度的样品中添加不同浓度（25，50，100 mg·L-1）的标准溶液，在最佳色谱条件下，每个添加平行进样三次并计算加标回收率，以评价该方法的准确度。

3 结果与讨论

3.1 色谱条件的选择与优化

3.1.1 检测波长

DCDNB，DCTNB 及TCDNB 在乙腈溶液的紫外光 谱 如 图1 所 示。由 图1 可 知，DCDNB，DCTNB 和TCDNB 的最大吸收波长均在240 nm 附近，即三种化合物在240 nm 波长处均有较强的紫外吸收响应，基质干扰较少，满足残留检测的要求。因此，选用240 nm 为检测波长。

图1 DCDNB，DCTNB 及TCDNB 在乙腈溶液中的紫外吸收光谱图Fig.1 UV absorption spectra of DCDNB，DCTNB and TCDNB in acetonitrile solution

3.1.2 流动相体系

由于DCDNB，DCTNB 及TCDNB 在甲醇和乙腈中均可溶解，因此选用纯乙腈溶解样品，分别选用甲醇/水，乙腈/水作为流动相进行检测，结果如图2 所示。由图2 可知，在甲醇/水，乙腈/水这两种流动相体系中，三种化合物紫外吸收峰的分离度均较大，分离效果良好，但在乙腈/水流动相体系中三种化合物的响应值明显较强，且TCDNB 在乙腈/水体系中的保留时间明显小于在甲醇/水体系中的保留时间。因此在乙腈/水体系下能够更快实现三种化合物的分离，提高分离效率，并且当乙腈作为流动相的有机相时可以有效避免溶剂对分析造成的干扰［17］。因此，本实验选用乙腈/水作为流动相体系。

图2 DCDNB，DCTNB及TCDNB在不同流动相体系中的色谱图Fig.2 Chromatograms of DCDNB，DCTNB and TCDNB in different mobile phase systems

3.1.3 流动相比例

由于DCTNB 及其合成过程中的杂质均不溶于水，流动相中的水相的占比不宜过大。因此，选取VACN/VWater分别为40/60，50/50，60/40，70/30，80/20，90/10 等不同比例的乙腈/水为流动相研究样品的液相色谱分离情况，结果如图3 所示。由图3 可知，随着流动相中乙腈比例的增大，流动相的洗脱能力增强，三种化合物的保留时间也相应的缩短。在VACN/VWater为40/60，50/50，60/40 时，DCDNB，DCTNB 和TCDNB依次出峰，实现了三种化合物的分离，但VACN/VWater为60/40 时，DCDNB 与DCTNB 两 化 合 物 的 紫 外 吸 收 峰相连；而VACN/VWater为70/30，80/20，90/10 时，DCDNB与DCTNB 的紫外吸收峰重合，未能实现分离。随后对VACN/VWater进行了微调，最终选用流动相VACN/VWater=55/45作为DCTNB高效液相色谱分析条件，在该条件下各组分均可实现基线分离，峰型对称，分离效果良好。

图3 DCDNB，DCTNB 和TCDNB 在不同比例乙腈/水体系中的色谱图Fig.3 Chromatograms of DCDNB，DCTNB and TCDNB in acetonitrile/water system with different ratio

3.1.4 流动相流速

流动相流速对被分析物的保留时间有较大的影响，适宜的流速能有效的减少保留时间，提高分离效率。分别考察了流动相流速为0.6，0.8，1.0，1.2，1.5 mL·min-1对分离效果的影响，结果如图4 所示。由图4 可知，DCDNB，DCTNB 和TCDNB 依次出峰，随着流速的增加，三种化合物的保留时间呈现缩短趋势，由0.6 mL·min-1时的17.63～26.98 min缩短至1.5 mL·min-1时的7.48～11.57 min，同时分离度也逐渐减小。虽然选用的五种不同流速均能满足液相色谱的分离要求，但流速越大，色谱柱的柱压越高，仪器的稳定性变差［18］，并且长时间的高柱压工作会对色谱柱的使用寿命造成影响，而流速较低时，三种化合物紫外吸收峰的峰宽变大，保留时间较长，使得实验分析的误差较大且效率较低。综合考虑柱压与保留时间，最终选择流动相流速为1.2 mL·min-1，在此流速下，三种化合物能够实现基线分离，分离效果良好，峰形对称，柱压适中，对仪器与色谱柱的影响较小，保留时间为9.20～14.17 min。

图4 DCDNB，DCTNB 和TCDNB 在不同流速下的色谱图Fig.4 Chromatograms of DCDNB，DCTNB and TCDNB at different flow rate

3.1.5 柱温

为减少色谱柱的温度对DCTNB 的色谱分析产生的影响，实验分别考察了样品在25，30，35，40，45 ℃等柱温下的分离效果，结果如图5 所示。结果表明，DCDNB，DCTNB 和TCDNB 依次出峰，随着柱温的升高，各组分的保留时间缩短，由25 ℃时的9.20～14.17 min 缩短至45 ℃时的8.44～13.37 min，但分离度下降，并且柱温过高会降低色谱柱的使用寿命。因此，为保护色谱柱以及操作的便捷，并参考实验室环境温度，选择室温25 ℃作为DCTNB 色谱分析的柱温。

图5 DCDNB，DCTNB 和TCDNB 在不同柱温下的液相色谱图Fig.5 Chromatograms of DCDNB，DCTNB and TCDNB at different column temperature

3.1.6 进样量

由于进样量的大小会对色谱的峰高和峰面积产生影响，进而影响分离效果。实验分别考察了样品进样量为5，10，15，20 μL 时的分离效果，结果如图6 所示。结果表明，当进样量为10 μL 时，三种化合物的分离效果良好，峰形对称，各吸收峰响应值适中；当进样量减少为5 μL 时，虽然分离效果良好，但各峰的响应值过低；而当进样量增加至15 或20 μL 时，峰形出现前延现象，分离效果明显下降。因此，选择体积10 μL 为DCTNB 色谱分析的进样量。

图6 DCDNB，DCTNB 和TCDNB 在不同进样量下的液相色谱图Fig.6 Chromatograms of DCDNB，DCTNB and TCDNB un⁃der different sample size

3.1.7 最优色谱分析条件

综上，本研究建立了DCTNB 纯度的高效液相色谱分析方法，并获得了最优色谱分析条件，色谱柱为Hypersil ODS2 色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），紫外检测波长为240 nm，流动相为VACN/VWater=55∶45，流速为1.2 mL·min-1，柱温为25 ℃，进样量为10 μL。最优色谱条件下DCTNB 样品的高效液相色谱图如图7 所示，DCDNB，DCTNB 和TCDNB 依次出 峰，保留时间分别为9.20，10.50，14.17 min，各峰的分离度（R）均大于3.70，分离效果良好，最优色谱条件下三种化合物的分离参数如表1 所示。

图7 最优HPLC 条件下DCDNB，DCTNB 和TCDNB 的高效液相色谱图Fig.7 Chromatograms of DCDNB，DCTNB and TCDNB under optimum condition of HPLC

表1 最优HPLC条件下DCDNB，DCTNB和TCDNB的分离参数Table 1 The separation parameters of DCDNB，DCTNB and TCDNB under optimum condition of HPLC

3.2 DCTNB 方法的验证

3.2.1 标准曲线与灵敏度

在最优色谱条件下，对不同浓度范围内的DCDNB，DCTNB 和TCDNB 标准溶液进行高效液相色谱分析，从低浓度到高浓度依次进样，每个浓度进样三次，使用外标法结合峰面积定量，获得三种化合物的标准工作曲线如图8 所示。由图8 可知，在5～250 mg·L-1的范围内，DCDNB 的浓度与色谱峰面积呈现良好的线性关系，线性方程为Y=27044.63X-43.70，R2=0.99942；在5～500 mg·L-1的范围内，DCTNB 的浓度与色谱峰面积呈现良好的线性关系，线性方程为Y=27863.51X-7.11，R2=0.99989；在5～250 mg·L-1的范围内，TCDNB的浓度与色谱峰面积呈现良好的线性关系，线性方程为Y=21548.70X-17.57，R2=0.99997。将5 mg·L-1的DCDNB，DCTNB 和TCDNB 标 准 溶 液 逐步稀释，分别在最优色谱条件下进行分析，测得检出限分别为0.47，0.68，0.85 mg·L-1，定量限分别为1.58，2.28，2.82 mg·L-1，表明该方法具有良好的灵敏度。

图8 DCDNB，DCTNB 和TCDNB 的标准曲线Fig.8 Standard curves of DCDNB，DCTNB and TCDNB

3.2.2 精密度与重复性

将DCDNB，DCTNB 和TCDNB 按比例（1∶1∶1）配制成总浓度为100 mg·L-1的混合样品溶液，在最佳色谱条件下，对样品溶液进行3 次平行的色谱分析，间隔6 h 后对该样品再次进行3 次平行的色谱分析，实验测得数据及各组分保留时间与峰面积的相对标准偏差（RSD）计算结果见表2。由表2 可知，样品中三种化合物的RSD 均小于1.27%，说明该方法的精密度与重复性较好，满足高效液相色谱定性及定量分析的要求。

表2 DCDNB，DCTNB 和TCDNB 的保留时间及峰面积的相对标准偏差Table 2 The relative standard deviations of retention time and peak area of DCDNB，DCTNB and TCDNB

3.2.3 准确度

采用加标回收率实验来定量分析方法的准确度，回收率越接近100%，该方法的准确度越高。向未知浓度的样品溶液中分别加入浓度为25.00，50.00，100.00 mg·L-1的标准溶液，在最优色谱条件下，未知浓度样品和每个添加水平平行进样3 次，求得平均回收率，结果见表3。由表3 可知，DCDNB，DCTNB 和TCDNB 的加标回收率在98.82%～102.13%之间，说明该方法具有良好的准确度。

表3 DCDNB，DCTNB 和TCDNB 的加标回收率Table 3 The standard recovery rate of DCDNB，DCTNB and TCDNB

4 结论

对于DCTNB 的合成及应用对于纯度分析的需求，进行了基于高效液相色谱法的DCTNB 纯度分析方法的建立与验证。

（1）通过探索检测波长，流动相体系及比例 流速、柱温和进样量等相关因素对DCDNB，DCTNB 和TCDNB 的分离效果的影响，建立了对于DCTNB 纯度分析的反相高效液相色谱分析方法。优化后的最优色谱条件为：Hypersil ODS2 色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），紫外检测波长240 nm，流动相为VACN/VWater=55∶45，流速1.2 mL·min-1，柱温25 ℃，进样量10 μL。实验结果表明，在最优色谱条件下，DCDNB，DCTNB和TCDNB 的保留时间依次为9.20，10.50，14.17 min，且三种化合物紫外吸收峰的分离度可达3.70 以上，能够对DCDNB，DCTNB 和TCDNB 达到良好的分离和分析。

（2）对所建立的分析方法进行了系统的验证，采用外标法对DCDNB，DCTNB 和TCDNB 进行了定量分析，在5～250 mg·L-1的范围内，DCDNB 的浓度与色谱峰面积均呈现良好的线性关系；在5～500 mg·L-1的范围内，DCTNB 的浓度与色谱峰面积呈现良好的线性关系；在5～250 mg·L-1的范围内，TCDNB 的浓度与色谱峰面积呈现良好的线性关系。DCDNB，DCTNB和TCDNB 的检出限分别为0.47，0.68，0.85 mg·L-1，定量限分别为1.58，2.28，2.82 mg·L-1，相对标准偏差不大于1.27%，加标回收率98.82%～102.13%。

结果表明，本研究建立的DCTNB 色谱分析方法具有良好的灵敏度、精密度、重复性与准确度，可用于DCTNB 的纯度分析、含量检测和质量控制等研究。