FKBP14蛋白通过调控IL-6/STAT3通路影响宫颈癌细胞增殖和凋亡的机制研究

赵娟 惠雪莲 祝小妮 陈梦捷 张晴 吉婷

宫颈癌(cervical cancer)是全球第四大常见的女性癌症[1]。其转移性也导致患者预后较差，易产生化疗耐药性，中位生存期8～13个月[2]。研究宫颈癌发展的分子机制，可以为其治疗提供分子靶点。FK506结合蛋白14(FKBP14)是一个免疫亲合蛋白亚家族，参与多种生化过程，有研究表明，FKBP14在宫颈癌发生过程中发挥癌基因的作用，抑制细胞凋亡和促进癌细胞转移[3]，但其具体机制尚不清楚。有报道显示，FKBP14在结肠癌中上调，通过IL-6/STAT3 通路促进癌细胞的增殖和迁移[4]。本研究假设FKBP14通过调控IL-6/STAT3通路影响宫颈癌细胞的增殖和凋亡，检测宫颈癌组织及细胞系中FKBP14的水平，及FKBP14在Hela细胞中对存活率和凋亡的影响，以期为宫颈癌靶向治疗提供新的靶点。

1 材料与方法

1.1 材料 选取2017年6月至2018年6月于陕西省西安市中医医院病理检查确诊为宫颈癌的患者手术切除的宫颈癌组织及癌旁组织(距离肿瘤组织边缘>2 cm)各30份，年龄22～72岁，平均年龄(48.9±15.1)岁。所有患者术前未接受放疗和化疗。本研究通过医院医学伦理委员会批准，并与所有患者签订知情同意书。

1.2 试剂与仪器 人正常宫颈上皮细胞HUCEC、宫颈癌Hela、SiHa和Caski细胞购自美国ATCC；RPMI-1640培养基和胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)购自美国Gibco公司，胰蛋白酶、JAK-STAT3信号通路抑制剂AG490、IL-6蛋白购自美国Sigma-Aldrich公司；CCK8检测试剂盒、细胞凋亡检测试剂盒购自上海碧云天生物科技有限公司；总RNA提取试剂TRIzol、Real-time PCR 试剂盒、反转录试剂盒(RT-PCR)购自宝生物工程(大连)有限公司；Lipofectamine 2000转染试剂购自美国Invitrogen公司；FKBP14、CyclinD1、Cleaved-caspase-3、IL-6、p-STAT3抗体和β-actin抗体购自美国Santa cruz公司；引物、FKBP14过表达载体(pcDNA3.1-FKBP14)、FKBP14干扰物(si-FKBP14)、阴性对照(si-NC和pcDNA-NC)载体购自上海吉玛制药有限公司；抗体购自美国Santa cruz公司。流式细胞仪购自美国BD公司，Real-time PCR仪购自美国Bio-rad公司。

1.3 方法

1.3.1 细胞培养:将Hela细胞接种在含10% FBS、100 U/ml青霉素和100 μg/ml链霉素的RPMI-1640培养基中，置于5% CO2、37℃培养箱中常规培养，用胰蛋白酶消化传代。

1.3.2 Real-time PCR检测FKBP14 mRNA的表达:收集宫颈癌组织、细胞系Hela、SiHa和Caski，用TRIzol试剂提取组织和细胞总RNA，然后按照反转录试剂盒说明书反转录合成cDNA，以cDNA为模板按照 Real-time PCR的说明书进行反应合成FKBP14 mRNA，上游引物为：5’-CGCAAGACCAAAGGAGGG-3’，下游引物：5’-TTTTCCATAGCCCAGAGCAG-3’。用2-ΔΔCt方法进行数据分析。

1.3.3 Western blot检测蛋白表达:收集宫颈癌组织、细胞系Hela、SiHa和Caski和/或转染后的各组Hela细胞，破碎组织和细胞，离心收集蛋白，将蛋白样本进行SDS-PAGE分离，然后将蛋白条带转PVDF膜，室温封闭2 h，洗膜后加入稀释的一抗(FKBP14抗体：1∶1 000、CyclinD1抗体1∶1 000、Cleaved-caspase-3抗体1∶1 000、IL-6抗体1∶2 000、p-STAT3抗体1∶1 000和β-actin抗体1∶3 000)，4℃过夜孵育，洗膜，加入稀释的酶标二抗，室温孵育1 h，显影，以β-actin 为内参照，分析蛋白表达水平。

1.3.4 细胞转染:将培养好的Hela细胞稀释为1×106个细胞/ml，以2×105个/孔接种于6孔板中，待细胞生长融合成单层时按照Lipofectamine 2000说明书进行转染。根据转染物分组：si-NC组和si-FKBP14组，pcDNA-NC组和pcDNA-FKBP14组。将各载体或片段转入Hela细胞中，转染48 h，收集细胞，进行后续实验。

1.3.5 CCK8法检测细胞增殖率:收集各组转染或处理后的Hela细胞，然后以2×103个细胞/孔接种于96孔板，在培养至48 h时进行CCK8实验，每孔加入10 μl CCK8溶液，培养2 h，酶标仪检测每孔细胞的OD450 nm(A)值。增殖率(%)=试验组A值/对照组A值×100%。

1.3.6 流式细胞术测定细胞凋亡率:收集各组Hela细胞，以每孔2×105个细胞接种于6孔板中培养48 h，弃去培养液，PBS缓冲液洗涤细胞2次，按照流式法细胞凋亡检测试剂盒说明书进行操作，上流式细胞仪检测细胞凋亡率。

2 结果

2.1 FKBP14 mRNA及蛋白在宫颈癌患者组织中的表达情况 qRT-PCR和Western blot结果显示，与癌旁组织(n=30)组比较，宫颈癌组织组中FKBP14 mRNA和蛋白含量显著升高(P<0.05)。见图1，表1。

图1 Western Blot检测FKBP14蛋白表达表1 FKBP14 mRNA和蛋白在宫颈癌组织中的表达

表1 FKBP14 mRNA和蛋白在宫颈癌组织中的表达

2.2 FKBP14 mRNA及蛋白在宫颈癌细胞系中的表达情况 qRT-PCR和Western blot结果显示，与人正常宫颈上皮细胞HUCEC组比较，宫颈癌细胞Hela、SiHa和Caski组中FKBP14 mRNA和蛋白含量显著升高(P<0.05)。FKBP14在3种细胞中表达趋势一致，后续实验选择表达差异较大的Hela细胞进行。见图2，表2。

表2 FKBP14 mRNA和蛋白在宫颈癌细胞系中的表达

图2 Western Blot检测FKBP14蛋白表达表2 FKBP14 mRNA和蛋白在宫颈癌细胞系中的表达

2.3 抑制FKBP14表达抑制Hela的增殖，促进其凋亡 与si-NC组比较，si-FKBP14组Hela细胞中FKBP14和增殖相关蛋白Cyclin D1含量显著下降，凋亡蛋白Cleaved-caspase-3含量显著升高，细胞增殖率降低，细胞凋亡率升高，差异有统计学意义(P<0.05)。见图3，表3。

图3 抑制FKBP14对Hela细胞凋亡的影响；A 流式细胞仪检测Hela细胞凋亡；B Western blot检测FKBP14、CyclinD1和Cleaved-caspase-3蛋白表达

表3 抑制FKBP14对Hela细胞存活和凋亡的影响

2.4 FKBP14表达对Hela细胞IL-6/STAT3通路相关蛋白表达的影响 与pcDNA-NC组比较，pcDNA-FKBP14组Hela细胞中IL-6和p-STAT3含量升高；与si-NC组比较，si-FKBP14组Hela细胞中IL-6和p-STAT3含量降低，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表4，图4。

图4 Western blot检测IL-6和p-STAT3蛋白表达

表4 FKBP14表达对Hela细胞IL-6/STAT3通路相关蛋白表达的影响

2.5 JAK-STAT3信号通路抑制剂AG490(50 μmol/L)可以逆转FKBP14对宫颈癌Hela的增殖、凋亡的影响 与pcDNA-NC组比较，pcDNA-FKBP14组Hela细胞中Cyclin D1和p-STAT3含量升高，Cleaved-caspase-3含量降低，细胞增殖率升高，凋亡率降低；加入JAK-STAT3信号通路抑制剂AG490(50 μmol/L)后，与pcDNA-NC组比较，pcDNA-NC+AG490组Hela细胞结果相反，细胞增殖率降低，凋亡率升高，差异均有统计学意义(P<0.05)。与pcDNA-FKBP14组比较，pcDNA-FKBP14+AG490组Hela细胞中Cyclin D1和p-STAT3含量升高，Cleaved-caspase-3含量降低，细胞增殖率升高，凋亡率降低，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表5，图5。

表5 JAK-STAT3信号通路抑制剂AG490逆转FKBP14对HeLa细胞增殖和凋亡的影响

图5 Western blot检测p-STAT3、CyclinD1和Cleaved-caspase-3蛋白的表达

2.6 IL-6蛋白可以逆转si-FKBP14对宫颈癌细胞Hela增殖凋亡的影响(100 ng/ml) 用100 ng/ml IL-6蛋白处理转染si-FKBP14的Hela细胞。结果表明，与si-NC组比较，si-FKBP14组Hela细胞中FKBP14和CyclinD1含量降低(P<0.05)，Cleaved-caspase-3表达升高，细胞存活率降低而凋亡率升高；si-NC+IL-6组细胞存活率升高而凋亡率降低，差异均有统计学意义(P<0.05)。与si-FKBP14组比较，si-FKBP14+IL-6组Hela细胞中FKBP14和CyclinD1含量升高(P<0.05)，Cleaved-caspase-3表达降低，细胞增殖率降低而凋亡率升高，差异均有统计学意义(P<0.05)。见图6，表6。

图6 Western blot检测FKBP14、CyclinD1和Cleaved-caspase-3蛋白的表达

表6 IL-6蛋白逆转si-FKBP14对Hela细胞增殖和凋亡的影响

3 讨论

FKBP14是FK506结合蛋白(FKBPs)家族成员之一，FKBPs是真核生物中一类高度保守的蛋白质，包含一个或多个顺反肽脯氨酰异构酶(PPIase)结构域，参与多种细胞功能，包括蛋白质折叠、细胞信号转导、细胞凋亡和转录等[5-7]。FKBP14通过直接结合和改变目标蛋白的构象来激发其功能，从而起到分子开关的作用，影响许多人类疾病产前发育和发病机制的细胞和分子途径，其结构域与分子信号和药物设计密切相关[8,9]。

FKBP14在胃癌[10]、卵巢癌[11]、骨肉瘤[12]和结肠癌[4]均表达上调，发挥癌基因的作用，是胃癌诊断、侵袭和预后的潜在生物标志物，可能是卵巢癌的诊断标志物和潜在分子靶点。还有研究发现，FKBP14在宫颈癌发生过程中可能通过抑制细胞凋亡和促进运动而发挥癌基因的作用，FKBP14有望成为宫颈癌治疗的潜在靶点[3]。本研究检测30例宫颈癌组织及癌旁组织及宫颈癌细胞Hela、SiHa和Caski中FKBP14的表达，结果发现FKBP14 的mRNA和蛋白在宫颈癌组织及细胞系中均表达上调，且在Hela细胞中抑制FKBP14的表达可降低细胞增殖率和Cyclin D1含量，提高细胞凋亡率和Cleaved-caspase-3蛋白含量，与上述研究结论[3]一致；过表达FKBP14则结果相反。

还有研究表明，FKBP14通过靶向IL-6/STAT3信号通路促进结肠癌细胞的增殖和迁移[4]。IL-6是一种多效性细胞因子，在肿瘤宿主中大量产生，已有研究表明，IL-6通过激活信号转导子和转录激活子3(STAT3)产生磷酸化(p-STAT3)，抑制树突状细胞(DC)激活T细胞的功能成熟，阻止肿瘤免疫的引入，因此阻断DC中IL-6/STAT3信号通路和靶分子可能提高癌症患者免疫治疗效果[13-16]。本研究根据以上研究结论，假设FKBP14通过靶向IL-6/STAT3信号通路调控宫颈癌细胞的增殖和凋亡。研究结果表明，过表达FKBP14可促进IL-6/STAT3信号通路蛋白IL-6和p-STAT3的表达，下调FKBP14可抑制IL-6和p-STAT3的表达；且JAK-STAT3信号通路抑制剂AG490可以逆转过表达FKBP14对宫颈癌Hela的增殖、凋亡的影响；IL-6蛋白(100 ng/ml)可逆转抑制FKBP14对Hela细胞增殖和凋亡的影响。

综上所述，本研究结果表明，FKBP14 的mRNA和蛋白在宫颈癌组织及细胞系中均表达上调，在Hela细胞中，FKBP14通过靶向IL-6/STAT3信号通路调控细胞的增殖和凋亡，提示FKBP14可能是宫颈癌的潜在分子靶点。