不同化皮、浓缩工艺对阿胶中核苷、氨基酸的影响

齐晓丹， 刘海滨， 牛伟霞， 高登锋， 王延涛， 王春艳,3， 李 丽,2，张 淹*

(1.东阿阿胶股份有限公司，山东 聊城 252201；2.山东省胶类中药技术创新中心，山东 聊城 252201；3.山东省胶类中药研究与开发重点实验室，山东 聊城 252201)

阿胶为马科动物驴EquusasinusL.的皮经去毛、化皮、浓缩等制备工艺，并加入冰糖、豆油等辅料后在高温下长时间炼制而成的传统补益类胶类中药，具有补血滋阴，润燥、止血等功效[1]，蛋白质含量约占其总量60%～85%，主要包括驴血清白蛋白[2]、核苷、微量元素、糖胺聚糖等[3-4]。近年来，对阿胶成分的研究主要集中在含量较高的蛋白质上，大多数学者认为阿胶发挥疗效的主要成分是胶原蛋白，2020年版《中国药典》也继续保留了其主要组成氨基酸的含量测定方法。但实际上阿胶是驴皮经化皮、浓缩、炼胶等长时间高温过程中逐渐降解后形成的复杂多元体系[5]，不同厂家阿胶生产工艺及辅料均存在一定差异，导致其所含成分含量、分子质量分布、物理性状等均有较大区别，故仅依据氨基酸含量来对阿胶生产工艺的合理性或优化进行精准评价仍具有局限性。

核苷作为维持生物生命活动的基本组成单元，在DNA代谢过程中扮演着重要角色，并且参与体内各种生理过程的调节，表现出多种生物活性，如免疫应答调节、抗血小板凝聚、抗心律失常、抗肿瘤、抗病毒等[6-7]，同时有一些也被证明为动物类药材的药效成分[8-10]。因此，本实验参考文献[11-14]，测定不同化皮、浓缩工艺中阿胶所含尿嘧啶、尿苷、胸腺嘧啶、鸟苷、腺苷的含量，并与2020年版《中国药典》收载的氨基酸(L-羟脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸、L-脯氨酸)含量进行比较，以期客观评价该药材生产工艺的合理性和科学性，也为工艺优化和药材质量标准完善提供参考。

1 材料

Waters型高效液相色谱仪，配置Waters 2998 PDA检测器(美国Waters公司)；MS105型电子分析天平(十万分之一，瑞士Mettler-Toledo公司)；KQ-800KDE型数控超声清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；BGZ-246型电热鼓风干燥箱(上海博迅实业有限公司)。化皮机组(1 m3，山东浩特能源设备有限公司)；WQ-005型单效外循环浓缩器(湖南精诚制药机械有限公司)。

尿嘧啶(批号100147-20030，纯度≥98.0%)、尿苷(批号100147-200302，纯度≥98.0%)、胸腺嘧啶(批号10047-200302，纯度≥98.0%)、鸟苷(批号111977-201501，纯度≥98.0%)、腺苷(批号110879-200202，纯度≥98.0%)、L-羟脯氨酸(批号111578-201602，纯度99.9%)、甘氨酸(批号140689-202006，纯度100.0%)、丙氨酸(批号140680-201604，检查及含量测定用)、脯氨酸(批号140677-201808，纯度99.9%)对照品均购于中国食品药品检定研究院。驴皮(5岁驴)由山东天龙牧业有限公司提供，经东阿阿胶股份有限公司牛伟霞副主任中药师鉴定为马科动物驴EquusasinusL.的干皮。乙酸铵、甲醇、乙腈为色谱纯；其他试剂均为分析纯；水为超纯水。

2 方法

2.1 制备工艺考察 根据文献[15-17]报道及实际生产过程中的化皮、浓缩工艺，将驴皮进行泡皮、焯皮后切块(2 cm×2 cm)混合，取10 kg，按表1条件处理，浓缩至相对密度为1.18(20 ℃)后进行冷冻干燥，平行3次。再采用2020年版《中国药典》四部通则“0832水分测定法”项下第二法，测定干燥后不同样品含水量。

表1 阿胶制备工艺条件

2.2 核苷含量测定

2.2.1 对照品溶液制备 精密称取尿嘧啶、尿苷、胸腺嘧啶、鸟苷、腺苷对照品适量，置于100 mL量瓶中，20 mL甲醇溶解，加水稀释至刻度，摇匀，制成质量浓度分别为0.105、0.176、0.109、0.242、0.287 mg/mL的贮备液，分别精密量取1.0 mL，置于100 mL量瓶中，20%甲醇定容至刻度，摇匀，即得。

2.2.2 供试品溶液的制备 参考文献[3,14]报道，精密称取按表1工艺条件制备的样品各1.5 g，置于25 mL量瓶中，水浴加热溶解，冷却，加水至刻度，摇匀，静置，精密吸取中层溶液3 mL，置于10 mL量瓶中，精密加入2 mL甲醇，加水定容至刻度，摇匀，滤过，即得。

2.2.3 色谱条件 Agilent Zorbox SB-Aq C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相1 mmol/L乙酸铵(A)-甲醇(B)，梯度洗脱(0～10 min，98%A；10～20 min，98%～95%A；20～35 min，95%～80%A；35～45 min，80%～60% A；45～50 min，60%A)；体积流量0.7 mL/min；检测波长260 nm[3]。色谱图见图1。

1.尿嘧啶 2.尿苷 3.胸腺嘧啶 4.鸟苷 5.腺苷图1 各核苷HPLC色谱图

2.3 方法学考察

2.3.1 线性关系考察 精密吸取“2.2.1”项下贮备液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL，置于100 mL量瓶中，20%甲醇定容至刻度，摇匀，在“2.2.3”项色谱条件下进样测定。以对照品峰面积(Y)对其进样量(X)进行回归，结果见表2，可知各核苷在各自范围内线性关系良好。

表2 各核苷线性关系

2.3.2 精密度试验 取同一批样品6份，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.2.3”项色谱条件下进样测定，测得尿嘧啶、尿苷、胸腺嘧啶、鸟苷、腺苷含量RSD分别为0.25%、0.65%、0.65%、0.64%、0.78%，表明仪器精密度良好。

2.3.3 稳定性试验 取“2.2.2”项下供试品溶液，室温下于0、1、2、4、6、12 h在“2.2.3”项色谱条件下进样测定，测得尿嘧啶、尿苷、胸腺嘧啶、鸟苷、腺苷峰面积RSD分别为0.15%、1.02%、0.54%、0.68%、0.94%，表明该方法稳定性良好。

2.3.4 重复性试验 取同一批样品6份，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.2.3”项色谱条件下进样测定，测得尿嘧啶、尿苷、胸腺嘧啶、鸟苷、腺苷含量RSD分别为0.25%、0.65%、0.65%、0.64%、0.78%，表明该方法重复性良好。

2.3.5 加样回收率试验 分别精密称取各核苷含量已知的样品1.262 9、1.314 5、1.296 8、1.285 7、1.365 4、1.326 4 g，置于25 mL量瓶中，加入对照品溶液(尿嘧啶、尿苷、胸腺嘧啶、鸟苷、腺苷质量浓度分别为5.841 6、8.045 2、21.232 1、9.896 9、9.813 3 μg/mL)5 mL，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.2.3”项色谱条件下进样测定，计算回收率。结果，尿嘧啶、尿苷、胸腺嘧啶、鸟苷、腺苷平均加样回收率分别为100.46%、100.05%、100.14%、99.48%、100.03%，RSD分别为1.52%、1.20%、0.91%、1.04%、1.37%。

2.4 氨基酸含量测定 参照2020年版《中国药典》一部阿胶项下方法进行测定。

2.4.1 对照品溶液制备 精密称取L-羟脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸、L-脯氨酸对照品适量，0.1 mol/L盐酸制成每1 mL分别含四者80 μg、0.16 mg、70 μg、0.12 mg的溶液，即得。

2.4.2 供试品溶液制备 取按表1工艺条件制备的阿胶约0.25 g，精密称定，置于25 mL量瓶中，加0.1 mol/L盐酸20 mL，超声(功率500 W、频率40 kHz)处理30 min，放冷，加0.1 mol/L盐酸至刻度，摇匀，精密量取2 mL，置于5 mL安瓿中，加2 mL盐酸，在150 ℃下水解1 h，放冷，移至蒸发皿中，用10 mL水分次洗涤，洗液并入蒸发皿中，蒸干，残渣加0.1 mol/L盐酸溶解，转移至25 mL量瓶中，加0.1 mol/L盐酸至刻度，摇匀，即得。

2.4.3 色谱条件 Agilent Zorbox SB-Aq C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相[乙腈-0.1 mol/L醋酸钠(醋酸调节pH值至6.5)(7∶93)](A)-[乙腈-水(4∶1)](B)，梯度洗脱，程序见表3；体积流量1 mL/min；柱温43 ℃；检测波长254 nm。色谱图见图2，理论塔板数按L-羟脯氨酸峰计，应不低于4 000。

表3 梯度洗脱程序

1.L-羟脯氨酸 2.甘氨酸 3.丙氨酸 4.L-脯氨酸图2 各氨基酸HPLC色谱图

2.5 数据分析 采用Microsoft Excel 2013软件处理数据，SPSS 20.0软件进行单因素方差分析。

3 结果

表4显示，高压化皮-减压浓缩工艺所制备样品中各核苷含量高于常压化皮-常压浓缩工艺所制备样品中(P<0.05)；化皮温度、时间对该类成分含量有明显影响，而浓缩温度、时间影响不显著。另外，4种工艺所制备样品中各氨基酸含量无显著差异(P>0.05)，也无规律性变化。

表4 各核苷、氨基酸含量测定结果(n=3)

4 讨论

在2020年版《中国药典》阿胶“制法”项中，仅简单描述为“将驴皮浸泡去毛，切块洗净，分次水煎，滤过，合并滤液，浓缩(可分别加入适量的黄酒、冰糖及豆油)至稠膏状，冷凝，切块，晾干，即得”，而化皮和浓缩工艺[15-17]作为该药材品质质量等级的关键工序之一，对驴皮中驴血清白蛋白、核苷、微量元素、糖胺聚糖等成分的溶出具有至关重要的影响。因此，本实验探索上述2种工艺对阿胶中核苷、氨基酸含量的影响。

结果显示，不同化皮工艺不仅是温度的差异，化皮时间也有所区别，其中高压化皮工艺温度高于常压化皮工艺，但化皮时间明显更短。为了使不同化皮工艺之间具有可比性，本实验选择一致的加水量，发现高压化皮过程中化皮设备始终处于一个密闭状态，默认所加溶剂量未变；常压化皮采用回流装置，可保证化皮溶剂量与高压化皮的一致。对于浓缩工艺而言，由于化皮溶剂量的一致也使得化皮液一致，故在浓缩过程中也未添加任何辅料。最终确定，核苷可作为阿胶化皮工艺优化的评价指标。