毛蕊花糖苷在常氧、缺氧大鼠体内药动学的比较

王维刚， 李晓琳， 燕 娜， 刘天龙， 王 芃， 郭姿良,， 吴 迪,5，李茂星,,5*

(1.联勤保障部队第九四○医院临床药学科，甘肃 兰州 730050；2.甘肃中医药大学药学院，甘肃 兰州 730000；3.甘肃省高原药学行业技术中心，甘肃 兰州 730050；4.兰州大学药学院，甘肃 兰州 730030；5.宁夏医科大学药学院，宁夏 银川 750004)

高原环境具有低压、低温、缺氧等特点[1]，其中缺氧是影响生命活动及疾病发展的重要因素之一，此时机体产生过度氧化应激，引发炎症反应、细胞凋亡、能量代谢紊乱等，导致脑肺损伤、记忆下降，加重运动疲劳，降低高原作业效能[2-4]。

毛蕊花糖苷是肉苁蓉、熟地黄、车前子等药用植物的指标成分[5-6]，它不仅可减轻脑组织损伤，而且具有良好的抗疲劳活性[7-8]；在体内外模拟肠道条件下可通过糖苷键及酯键断裂，分解为羟基酪醇和咖啡酸[9-10]；灌胃给药后吸收迅速，分布广泛，生物利用度良好[11]；尾静脉注射给药后可快速代谢产生羟基酪醇，并且后者在体内可被快速代谢和消除[12]。

课题组前期研究发现，毛蕊花糖苷、羟基酪醇、咖啡酸均具有良好的体外抗氧化活性，而且前两者还能改善PC12细胞缺氧损伤，表明毛蕊花糖苷口服给药后可能是原药与其代谢产物羟基酪醇、咖啡酸协同发挥作用。本实验比较了毛蕊花糖苷在常氧、缺氧大鼠体内药动学，以期为该成分后续研究提供参考。

1 材料

1.1 试剂与药物 毛蕊花糖苷原料药(纯度≥94%，自制)；毛蕊花糖苷(纯度≥98%，批号PS000683)、羟基酪醇(纯度≥98%，批号PRF10100843)、咖啡酸(纯度≥98%，批号102913)、染料木素(纯度≥98%，批号PRF9112103)对照品(成都普瑞法科技开发有限公司)。色谱纯乙腈(瑞典Oceanpak公司，批号20100310G202)；色谱纯甲酸(批号xk-011-00017)、乙酸乙酯(批号2020102201)(四川科伦药业股份有限公司)；水为屈臣氏蒸馏水。

1.2 仪器 Agilent 1290超高效液相色谱仪、Agilent 6560离子淌度飞行时间质谱仪(美国Agilent公司)；FLYDWC50-ⅡC低压低氧动物实验舱(贵州风雷航空军械有限公司)；JPXH-D可调式涡旋混匀器(上海旌派仪器有限公司)；3K15高速冷冻离心机(美国Sigma公司)；BP210S电子天平(德国赛多利斯公司)RUC-2-25离心浓缩仪(德国Labconco公司)。

1.3 动物 SPF级Wistar大鼠，雄性，体质量(200±20)g，购自中国人民解放军联勤保障部队第九四○医院动物实验科，动物使用许可证号SYXK(军)2017-0046，饲养室温度(25±2)℃，相对湿度40%～60%，标准饲料喂养，自由进水。实验经联勤保障部队第九四○医院动物伦理委员会批准(审批编号2020KYLL121)。

2 方法与结果

2.1 HPLC-QTOF-MS分析条件

2.1.1 色谱 Thermo Hypersi1 GOLD色谱柱(100 mm×2.1 mm，1.9 μm)；Thermo嵌入式保护柱套(2 mm)；Thermo Hypersil GOLD保护柱柱芯(2.1 mm×0.2 μm)；流动相乙腈(A)-水(含0.1%甲酸)(B)，梯度洗脱，程序见表1；体积流量0.4 mL/min；柱温35 ℃；检测波长281 nm；进样量2 μL。

表1 梯度洗脱程序Tab.1 Gradient elution programs

2.1.2 质谱 电喷雾离子源(ESI)；干燥器温度225 ℃，体积流量7.0 L/min；雾化器压力25 psi(1 psi=6.895 kPa)；鞘气(N2)温度325 ℃，体积流量12.0 L/min；毛细管电压4 000 V；喷嘴电压1 000 V；负离子检测模式，m/z100～750；提取离子羟基酪醇m/z153.055 7，咖啡酸m/z179.035 0，毛蕊花糖苷m/z623.198 1，内标(染料木素)m/z269.048 8，各成分全扫描质谱图见图1。

图1 各成分全扫描质谱图Fig.1 Full scan MS spectra for various constituents

2.2 溶液制备

2.2.1 给药液 称取毛蕊花糖苷原料药适量，灭菌注射用水溶解，即得(质量浓度为30 mg/mL)。

2.2.2 对照品、内标溶液 精密称取毛蕊花糖苷、羟基酪醇、咖啡酸对照品0.002 0 g，置于10 mL棕色量瓶中，乙腈超声溶解后加水定容，即得对照品溶液(质量浓度均为200 μg/mL)。精密称取染料木素对照品0.002 0 g，同法制备内标溶液。

2.2.3 血浆标准曲线样品、质控样品溶液 将“2.2.2”项下对照品溶液用50%乙腈依次稀释至100、200、500、1 000、2 000、5 000、10 000、20 000 ng/mL，分别吸取5 μL至EP管中，加入45 μL空白血浆，涡旋混匀1 min，即得血浆标准曲线样品溶液(质量浓度为10、20、50、100、200、500、1 000、2 000 ng/mL)。同法制备毛蕊花糖苷、羟基酪醇、咖啡酸质量浓度分别为20、100、500 ng/mL的质控样品溶液。

2.3 血浆处理 大鼠血浆4 000 r/min离心10 min，取上清50 μL，加入乙酸乙酯400 μL、内标溶液(4 μg/mL)2 μL，涡旋10 min，12 000 r/min离心15 min，取乙酸乙酯层至1.5 mL离心管中，萃取2次，37 ℃离心浓缩仪上挥干，50 μL 5%乙腈复溶，15 000 r/min离心5 min，取上清液，进行HPLC-QTOF-MS分析。

2.4 建模、给药与采血

2.4.1 常氧大鼠 将7只大鼠编号并称定质量，每只按300 mg/kg剂量灌胃给予“2.2.1”项下给药液。大鼠给药前12 h禁食，自由饮水，于给药前和给药后5、10、15、30、45 min及1、1.5、2、4、6、8、12、24 h眼眶静脉采集全血各0.3 mL，置于肝素化EP管中，在-20 ℃下保存，按“2.3”项下方法处理，进行HPLC-QTOF-MS分析。

2.4.2 缺氧大鼠 将7只大鼠编号后置于低压低氧动物实验舱中，在模拟高原7 500 m下缺氧暴露3 d，制备缺氧模型。大鼠给药前12 h禁食，自由饮水，称定质量后每只按300 mg/kg剂量灌胃给予“2.2.1”项下给药液，于给药前和给药后5、10、15、30、45 min及1、1.5、2、4、6、8、12、24 h眼眶静脉采集全血各0.3 mL，置于肝素化EP管中，在-20 ℃下保存，按“2.3”项下方法处理，进行HPLC-QTOF-MS分析。

2.6 方法学考察

2.6.1 专属性试验 取6个来源大鼠空白血浆适量，加入“2.2.2”项下对照品(20 ng/mL)、内标溶液，按“2.3”项下方法处理，在“1.4”项条件下进样测定，结果见图2，可知该方法专属性良好。

2.6.2 线性关系考察 取“2.2.3”项下血浆标准曲线样品溶液适量，按“2.3”项下方法处理，在“1.4”项条件下进样测定。以对照品质量浓度为横坐标(X)，对照品与内标峰面积比值为纵坐标(Y)进行回归，并以S/N=10为定量限，结果见表2，可知各成分在各自范围内线性关系良好。

表2 各成分线性关系Tab.2 Linear relationships of various constituents

2.6.3 精密度、准确度试验 取“2.2.3”项下血浆标准曲线样品溶液适量，按“2.3”项下方法处理，在“1.4”项条件下进样测定，同一天内连续进行6次，计算日内精密度；连续进行3 d，每天1次，计算日间精密度，并考察方法准确度，结果见表3。由此可知，各成分日内、日间精密度RSD均小于12%，准确度均在94.89～111.52%范围内，符合生物样品分析要求。

表3 各成分准确度、精密度试验结果(n=6)Tab.3 Results of accuracy and precision tests for various constituents(n=6)

注：a～e分别为总离子流图及羟基酪醇、咖啡酸、染料木素、毛蕊花糖苷提取离子流图。图2 各成分HPLC-QTOF色谱图Fig.2 HPLC-QTOF chromatograms of various constituents

2.6.4 提取回收率、基质效应试验 取“2.2.3”项下血浆标准曲线样品溶液适量，每个质量浓度6份，按“2.3”项下方法处理，在“1.4”项条件下进样测定，得峰面积A1；另取空白血浆，按“2.3”项下方法处理，浓缩仪挥干后残渣分别用20、100、500 ng/mL对照品溶液复溶，在“1.4”项条件下进样测定，得峰面积A2；取20、100、500 ng/mL对照品溶液适量，在“1.4”项条件下进样测定，得峰面积A3，以A1与A2的比值计算提取回收率，A2与A3的比值计算基质效应，结果见表4。由此可知，该方法下毛蕊花糖苷、咖啡酸提取回收率、基质效应均在85%以上，而羟基酪醇更达到90%以上。

表4 各成分提取回收率、基质效应试验结果Tab.4 Results of extraction recovery rate and matrix effect tests for various

2.6.5 稳定性试验 取“2.2.3”项下血浆标准曲线样品溶液适量，每个质量浓度5份，按“2.3”项下方法处理，分别于室温[(21±2)℃]下放置6 h、4 ℃下放置6 h，-20 ℃下保存7 d、-20 ℃下冻融3次后在“1.4”项条件下进样测定，结果见表5。由此可知，在上述条件下各成分峰面积RSD均小于10%，表明血浆稳定性良好。

表5 各成分稳定性试验结果(n=5)Tab.5 Results of stability tests for various constituents(n=5)

2.7 体内药动学研究 在常氧、缺氧大鼠血浆中均未检测到羟基酪醇，毛蕊花糖苷、咖啡酸主要药动学参数见表6，血药浓度-时间曲线见图3～4。由此可知，与常氧大鼠血浆比较，缺氧大鼠血浆中毛蕊花糖苷AUC0～t、AUC0～∞、Cmax降低(P<0.05)，Tmax、Vz/F升高(P<0.05)；咖啡酸AUC0～t、AUC0～∞、Cmax降低(P<0.05)，MRT0～∞、Tmax、Vz/F升高(P<0.05)。

表6 毛蕊花糖苷、咖啡酸主要药动学参数Tab.6 Main pharmacokinetic parameters for verbascoside and caffeic

图3 毛蕊花糖苷血药浓度-时间曲线Fig.3 Plasma concentration-time curves for verbascoside

图4 咖啡酸血药浓度-时间曲线Fig.4 Plasma concentration-time curves for caffeic acid

3 讨论

课题组前期发现，灌胃给予大鼠300 mg/kg毛蕊花糖苷后呈现出良好的抗缺氧、抗疲劳活性[7-8]。因此，为了进一步探究毛蕊花糖苷药效基础，本实验也选择300 mg/kg作为给药剂量。

高原低氧对机体的物质代谢系统、循环系统、血液系统等均有显著影响，从而影响药动学过程[13-16]。本实验在常氧、缺氧大鼠体内检测到了毛蕊花糖苷和咖啡酸，但未发现羟基酪醇。在体内胃肠道及体外模拟消化条件下，毛蕊花糖苷水解生成羟基酪醇[9-10]；静脉注射给予毛蕊花糖苷后，在血浆中可检测到羟基酪醇[12]，而且在肝脏中快速转化为次级代谢产物[17]，故推测羟基酪醇可能被肝脏快速代谢，使血浆中其浓度低于检测限。

与常氧大鼠比较，缺氧大鼠血浆中毛蕊花糖苷AUC0～t、AUC0～∞、Cmax分别降低50%、48%、55%，Tmax增加114%，表明毛蕊花糖苷吸收强度降低一半左右，吸收速度减慢。缺氧可导致Caco-2细胞P-gp表达上调，使药物外排增多，减少药物吸收，导致芍药苷、左氧氟沙星、甲硝唑吸收降低[10,18-20]，推测缺氧大鼠毛蕊花糖苷吸收减弱的原因一方面可能与大鼠小肠外排蛋白P-gp表达上调、外排作用增强有关，从而降低小肠对药物的吸收[18]，而另一方面缺氧可导致大鼠胃排空作用减弱[21]；Vz/F显著升高，可能是AUC、Cmax降低的原因，并且课题组前期发现，毛蕊花糖苷与缺氧大鼠血浆蛋白结合率降低，导致该成分更容易向组织中分布，可能导致该参数升高。另外，缺氧大鼠血浆中咖啡酸AUC、Cmax显著降低，Tmax显著延长，提示该成分体存量减少，其原因可能与P-gp表达上调及减缓胃排空有关，也可能与代谢生成速率减慢有关；Tmax、Vz/F、t1/2z、MRT0～∞显著增加，提示缺氧状态下该成分在大鼠体内代谢减慢，平均驻留时间延长，组织分布增加。

综上所述，毛蕊花糖苷在缺氧大鼠体内药动学发生明显变化；缺氧损伤后，毛蕊花糖苷及其代谢产物咖啡酸组织分布增加，但吸收减弱，体存量减少，在一定程度上制约了药效发挥。因此，在实际抗缺氧用药过程中应增加毛蕊花糖苷剂量，以期保证其药效基础。