苹果锈果类病毒内蒙古金红分离物的基因组序列分析

袁彧伟，付崇毅，孙平平，马 强，张 斌，李正男，张 磊

(1 内蒙古农业大学 园艺与植物保护学院，内蒙古 呼和浩特010018；2 内蒙古自治区农牧业科学院，内蒙古 呼和浩特010031；3 内蒙古师范大学 生命科学与技术学院，内蒙古 呼和浩特010022)

苹果锈果类病毒(apple scar skin viroid,ASSVd)属于马铃薯纺锤块茎类病毒科(Pospiviroidae)苹果锈果类病毒属(Apscarviroid)成员[1]。ASSVd基因组为单链环状RNA，全长329～334 nt，具有棒状或拟杆状的二级结构，可分为左末端区(left terminal domain，TL)、致病区(pathogenicity domian，P)、中央保守区(central domain，C)、可变区(variable domain，V)和右末端区(right terminal domain，TR)5个结构域，其中可变区(V)与ASSVd在不同植物寄主上引起的症状差异有关[2]。ASSVd具有自我复制功能，但不编码蛋白，而是依赖寄主的蛋白来完成转运、复制和致病等功能。早在20世纪30年代，Ohtsuka等在中国种植的国光苹果上发现了苹果锈果病[3]。1985年，陈炜等[4]从中国农业科学研究院郑州果树所、北戴河海滨园艺场和西山园艺场、中国农业科学院果树研究所等地采集的表现为锈果、裂果的国光、鸡冠和白龙等苹果样品中检测到了环状RNA分子，这是国内首次发现ASSVd的RNA。1987年，Hashimoto等[5]首次报道了全长为329 nt的ASSVd日本分离物完整基因组序列。越来越多的研究证明，ASSVd在世界范围内广泛分布。20世纪50年代曾在美国苹果园出现的“苹果斑纹病”，后又陆续出现的中国梨树“梨锈皮病”、“梨皱果病”，以及给日本造成严重经济损失的“日本梨凹果病”等，均与ASSVd有关[6-8]。

ASSVd侵染苹果可引起苹果锈果病和苹果花脸病，症状主要表现在果实上，包括果皮表面着色不均匀、出现斑纹或铁锈状斑，果实畸形、开裂等，不仅影响苹果产量，而且还影响苹果品质，给苹果产业造成了巨大的经济损失。除此之外，ASSVd还可危害梨(Pyruscommunis)、桃(Prunuspersica)、杏(Prunusarmeniaca)、野樱桃(Prunuscerasoides)等果树，导致其果实表面出现瘢痕、斑纹，失去商品价值，具体症状与果树品种有关[9-12]。Walia等[13]通过构建ASSVd的侵染性克隆，证明ASSVd还可以侵染黄瓜(Cucumissativus)、番茄(Solanumlycopersicum)、菜豆(Phaseolusvulgaris)、豌豆(Pisumsativum)、茄子(Solanummelongena)、本氏烟(Nicotianabenthamiana)、心叶烟(Nicotianaglutinosa)、普通烟(Nicotianatabacum)、昆诺黎(Chenopodiumquinoa)等草本寄主，其中侵染黄瓜后可导致黄瓜植株轻度发育不良和叶片褪绿，侵染菜豆后导致菜豆植株叶片脉间褪绿等症状，但其他草本寄主均未表现症状。ASSVd主要通过嫁接和机械摩擦传播，但在苹果和梨上发现种子可以带毒[14]，已有研究发现温室白粉虱(Trialeurodesvaporariorum)可将ASSVd裸露的RNA传播给黄瓜、番茄、菜豆等草本植物[15]。

一直以来，ASSVd都是阻碍我国苹果产业健康发展的主要病原物之一。树体一旦感染ASSVd将终身带毒，即使根除感病果树，果园中仍会再次出现果树发病的现象，这一问题在辽宁[16]、山东[17]、河北[18]、新疆[19]、陕西[20]等地均有报道。内蒙古自治区属于我国东北冷寒苹果产区，主要栽培苹果有鸡心果、黄太平、金红等小苹果，在赤峰等地还有寒富和富士等大苹果，近年来已经有ASSVd在内蒙古地区鸡心果上发生的报道[18]，但在金红和黄太平苹果品种上尚无ASSVd发生的报道。本研究在内蒙古自治区园艺研究院实验农场表现花脸症状的金红苹果上检测到ASSVd的发生，克隆测序了其全长基因组，并对其核苷酸序列进行分析，以期为苹果锈果类病毒的有效防控提供参考。

1 材料与方法

1.1 供试材料

2020年8月，在内蒙古自治区园艺研究院实验农场的8株金红苹果树中，发现有3株果实表现出花脸症状(图1)，采集3株有花脸症状和2株果面正常的金红苹果叶片，用锡箔纸包裹，液氮速冻后立刻带回实验室，保存于-80 ℃冰箱备用。

SpectrumTMPlant Total RNA Kit，购自Sigma公司；PrimeScriptTMⅡ 1st Strand cDNA Synthesis Kit、EscherichiacoliJM109 Competent Cells等，购自TaKaRa公司；零背景pTOPO-TA 克隆试剂盒，购自北京艾德莱生物科技有限公司；2×M5 Hiper超光速mix，购自北京聚合美生物科技有限公司；E.Z.N.A.®Gel Extraction Kit，购自Omega公司；其他生化试剂及普通化学试剂均为进口或国产分析纯，购自天根生物有限公司；引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.2 试验方法

1.2.1 总RNA提取及cDNA第一链合成 利用SpectrumTMPlant Total RNA Kit从采集的花脸症状和正常金红苹果叶片样品中提取植物总RNA，提取方法参照试剂盒说明书。总RNA经Nano-300微量分光光度计(杭州奥盛仪器有限公司)测定浓度和纯度，通过琼脂糖凝胶电泳检测完整性后保存于-80 ℃冰箱中备用。以获得的总RNA为模板合成cDNA第一链，反转录体系：以1 μg植物总RNA为模板，Ramdom 6 primer(50 μmol/L)为引物,加入1 μL dNTP Mix(10 mmol/L)，用RNase free dH2O补足至10 μL，65 ℃ 5 min，冰置2 min。变性后在反应液内再加入4 μL 5×PrimeScript Ⅱ Buffer、0.5 μL RNase Inhibitor(40 U/μL)、1 μL PrimeScript Ⅱ RTase(200 U/μL)，用RNase free H2O补足至20 μL。反应程序：30 ℃ 10 min，42 ℃ 30 min，95 ℃ 5 min。反应结束后将获得的cDNA置于-20 ℃保存。

1.2.2 RT-PCR检测及全长基因组扩增 根据NCBI的GenBank数据库中211条ASSVd基因组信息，设计1对用于检测和扩增ASSVd基因组的引物，上游引物ASSf：GGTAAACACCGTGCGGTCCC，下游引物ASSr：GGGAAACACCTATTGTGTTT，退火温度52 ℃，目标片段长330 bp。

用反转录合成的cDNA为模板进行ASSVd的RT-PCR检测，以ASSf、ASSr为引物，反应体系：2×M5 Hiper超光速mix 10 μL，上游引物ASSf 1 μL，下游引物ASSr 1 μL，cDNA模板2 μL，用RNase free H2O补足至20 μL。PCR反应程序：95 ℃预变性3 min；94 ℃变性30 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，循环35次；72 ℃延伸5 min。PCR产物用1.0%琼脂糖凝胶电泳进行分离，在紫外灯下切取目标片段，用E.Z.N.A.®Gel Extraction Kit试剂盒回收纯化目的片段。利用TA克隆试剂盒将目的片段连接到pTOPO-T克隆载体上，转化EscherichiacoliJM109 Competent Cells，经菌液PCR鉴定后挑选阳性克隆送至华大基因科技有限公司进行测序。

1.2.3 序列分析与系统发育分析 将得到的ASSVd全长序列通过NCBI数据库的Blastn程序进行同源性搜索，再从GenBank数据库中下载具有代表性的ASSVd分离物序列，用于后续一致性分析和系统发育分析。基于全长基因组核苷酸序列，用MEGA 6.0软件对本试验获得的ASSVd内蒙古金红分离物以及从NCBI的GenBank数据库中下载的来自不同地区和不同寄主的15个ASSVd分离物进行系统发育分析，采用邻接法构建进化树，以苹果凹果类病毒(apple dimple fruit viroid，ADFVd)意大利坎帕尼亚苹果分离物作为外群，自展值设为1 000。用于分析的ASSVd及ADFVd分离物基因组序列信息如表1所示。

表1 用于系统发育分析与核酸一致性分析的ASSVd和ADFVd分离物基因组序列Table 1 Sequences of ASSVd and ADFVd genome used for phylogenetic and identity analyses

1.2.4 多重对比分析 研究表明，ASSVd基因组中的核苷酸位点插入、缺失、替换等变异主要集中在致病区，且各位点是否发生变异与寄主的种类有关[21]。因此利用DNAMAN软件，对获得的ASSVd内蒙古金红分离物与不同地区、不同寄主种类的ASSVd分离物进行序列多重对比分析。

1.2.5 RNA二级结构预测 ASSVd基因组为闭合环状RNA，容易形成棒状二级结构。利用RNA二级结构线上分析工具RNA Folding Form对ASSVd内蒙古金红分离物的基因组二级结构进行预测。

2 结果与分析

2.1 ASSVd内蒙古金红分离物的RT-PCR检测

ASSVd内蒙古金红分离物的RT-PCR检测结果见图2。

从表现花脸症状的金红苹果叶片样品中提取植物总RNA,经反转录后得到cDNA，以cDNA为模板扩增到长约330 bp的条带，与目标片段大小一致，2株果面健康的苹果叶片样品中没有获得任何PCR产物(图2)。

2.2 ASSVd内蒙古金红分离物的测序与系统发育分析

将3个PCR检测为阳性的样品分别送3个阳性克隆至华大基因科技有限公司进行测序，结果显示，9个阳性克隆之间的一致性为100%，所以选择其中1条序列进行后续分析。将序列提交至NCBI，获得GenBank登录号为MZ476527。将获得序列通过Blastn程序进行对比，发现其与ASSVd新疆梨分离物(JX861258)的一致性最高，为97.9%，表明花脸症状的金红苹果确实感染了ASSVd。从NCBI数据库中下载具有代表性，且分布不同地区和不同寄主种类的ASSVd分离物全基因组序列进行系统发育分析,结果见图3。图3显示，所有ASSVd分离物分成2个组群，外群苹果凹果类病毒为一个独立的组群，ASSVd内蒙古金红分离物与新疆梨分离物(JX861258)、内蒙古塞外红苹果分离物(MN598205)、北京苹果分离物(HQ840722)、山东苹果分离物(KY963660)、新疆库尔勒苹果分离物(KC110859)、内蒙古塞外红苹果分离物(MN598204)和加拿大苹果分离物(X71599)聚集在一个组群内，其中ASSVd内蒙古金红分离物与新疆梨分离物(JX861258)的系统发育关系最近，与内蒙古塞外红苹果分离物(MN598205)次之。ASSVd分离物的系统进化分析显示，其系统发育与地理来源和寄主种类的相关性不大。

2.3 ASSVd序列一致性和多重对比分析

本研究获得的ASSVd内蒙古金红分离物与NCBI数据库中下载的其他15个ASSVd分离物的基因组核苷酸序列一致性为87.5%～97.9%，其中ASSVd内蒙古金红分离物与新疆梨分离物(JX861258)的核苷酸一致性最高，为97.9%，与内蒙古塞外红苹果分离物(MN598204)的核苷酸一致性最低，为87.5%。选择部分具有代表性的ASSVd分离物，利用DNAMAN软件与本研究获得的ASSVd内蒙古金红分离物进行序列多重对比分析，结果如图4所示。

由图4可知，ASSVd各分离物之间的核苷酸一致性较高，左末端区和中央保守区的保守区域同源性都很高。第39～53位核苷酸和第244～263位核苷酸是变异较大的2个区域，且均集中在基因组的致病区及与其相邻区域的连接处，具体为左末端区、致病区和中央保守区。

参照刘娟[21]、刘洪玉等[22]、陈冉冉等[23]的研究，以Puchta等[24]1990年在中国苹果上获得的ASSVd分离物全长序列(NC001340)为标准序列，将ASSVd内蒙古金红分离物序列(MZ476527)与其进行对比发现，2个分离物序列之间的一致性为91.1%，共有38个核苷酸位点发生变异(图5)。由图5可知，获得序列中有33个核苷酸位点发生替换，2个核苷酸位点缺失(G115,C254)，3个核苷酸位点插入(A124,T177,C210)，且主要集中在中央保守区、可变区和右末端区。但是这种对比方法适用于刘娟[21]在获得多条ASSVd全长序列或多个ASSVd分离物时进行分析，所以本试验只就多重对比分析结果进行讨论。

2.4 ASSVd内蒙古金红分离物RNA的二级结构预测

利用RNA二级结构在线预测工具RNA Folding Form，导入本试验获得的ASSVd内蒙古金红分离物全基因组序列，选择环状RNA，其他参数保持默认设置，预测结果(图6)表明，自由能为-499.49 kJ/mol。ASSVd的基因组为环状单链RNA,容易形成稳定的杆状二级结构，且其中有许多“环”。

3 讨 论

与其他马铃薯纺锤块茎类病毒科的类病毒相比，ASSVd缺少中央保守区域的GAAAC序列，并且与他们的序列同源性也很低[5]。马铃薯纺锤块茎类病毒(potato spindle tuber viroid,PSTVd)和ASSVd同属于马铃薯纺锤块茎类病毒科，是马铃薯纺锤块茎类病毒属(Pospiviroid)的代表种。PSTVd与ASSVd在部分区域存在同源序列，研究证明其RNA二级结构上的“环”对于PSTVd的复制和转运极其重要，并且5个结构域都与症状的表达有关[25]。有研究者认为,ASSVd的二级结构可能也有同样的作用[17]，但还需要更深入的研究来证明[17]。PSTVd的中央保守区形成稳定的双相结构，可以折叠成一个具有环状结构的PSTVd分子，认为其是类病毒复制中间体加工的关键，在PSTVd及其他类病毒的复制和加工中发挥着重要作用，但在ASSVd上的类似功能仍然不确定，还需要对ASSVd的二级结构做进一步研究。

本研究系统发育分析结果表明，获得的ASSVd内蒙古金红分离物与新疆梨分离物(JX861258)的亲缘关系最近，核苷酸序列一致性也最高，为97.9%；其次是内蒙古塞外红苹果分离物(MN598205)，二者序列一致性为97.0%。本试验所采集的感病金红样品来自呼和浩特市，而感病塞外红苹果来自通辽市，两者的砧木同为山定子(MalusbaccataBorkh.)，但本试验所用金红已有18年树龄，获得的ASSVd分离物是否是由感病植物材料的远距离运输导致的，目前还不能确定。将本试验获得的ASSVd内蒙古金红分离物与来自不同地区和不同寄主种类的ASSVd分离物进行多重对比分析发现，变异位点主要集中在RNA二级结构的左末端区、致病区和中央保守区，这与刘洪玉等[22]对ASSVd山东舞美苹果分离物、张富军等[17]对ASSVd山东火焰海棠苹果分离物、赵玲玲等[26]对ASSVd烟台富士苹果分离物的研究结果一致,但与Yazarlou等[27]“ASSVd变异位点集中在左端区、致病区和右端区”的研究结果稍有出入。系统发育分析结果与序列对比结果一致，ASSVd内蒙古金红分离物与山东苹果分离物(KY963660)在同一个组群中，而伊朗苹果分离物(HQ326090)在另一个组群。印度学者Walia等[13]用构建的ASSVd侵染性克隆成功侵染黄瓜并表现症状后，通过单链构象多态性分析发现，从被侵染黄瓜中获得的类病毒子代中存在4种类型的序列变异，形成了V1、V2、V3、V4 4个变种。其中V1和V3属于优势变种，在草本寄主黄瓜上的侵染力和症状表达存在差异；V1与野生型ASSVd的同源性为96%，两者间的差异主要体现在二级结构致病区的10个核苷酸位点，并且这些核苷酸位点的变化导致了V1二级结构左端区第9个“环”发生了改变。查富蓉[28]通过对山东、山西、辽宁等地不同苹果品种的ASSVd分离物序列进行对比，发现10个特异性的变异位点，并且部分中国分离物会聚成一个独特的组群。ASSVd某些核苷酸位点的变异会导致二级结构的变化，这可能与抵抗寄主的防御机制或增强对新寄主的适应能力有关，也可能与不同分离物的系统发育分支结果有关。本试验所获得的分离物序列样本较少，要进行深入研究还需要更多的序列对比结果。

内蒙古属于我国东北冷寒苹果产区，主栽苹果品种具有较强耐寒性、抗旱性，其中小苹果是极具地方特色，深受消费者喜爱的一类苹果，因其果形小、果质量小而称为小苹果。2013年郝璐等[29]在北京苹果园首次发现小苹果被ASSVd侵染，后续Li等[18]在内蒙古、河北、辽宁等地种植的小苹果塞外红上也检测到ASSVd。本研究在内蒙古表现花脸的金红苹果上也检测到ASSVd。ASSVd主要靠嫁接传播，侵染果树后有一定的潜伏期，感病果树可能不会立即显症，因此需要通过严把植物材料转运检疫关，嫁接时注意工具的消毒，以及利用植物病毒检测技术加强对苹果产区各果园内ASSVd的监测等手段来进行防控。