波卓链霉菌合成纳米硒的物理化学表征及其抑菌促生活性

何 斐，崔 鸣，王 甜，杜小平，张博泉，朱锦镕，冯明月

(1安康学院 现代农业与生物科技学院，陕西 安康 725000；2 安康市富硒产品研发中心 农业农村部富硒产品开发与质量控制重点实验室，陕西 安康 725000)

硒(Se)是生物体必需的微量元素之一，但硒过量则产生毒害[1]。与无机硒亚硒酸盐(SeO32-)、硒酸盐(SeO42-)和有机硒化合物(Se2-)相比，纳米硒(Selenium nanoparticles，SeNPs)是一种新型单质硒，其毒性低、生理活性强、易吸收，在农业、食品、环境监测、化工及医药等领域具有广阔的应用前景[2]。如在农业领域，利用SeNPs作为肥料添加剂，可有效增强植株抗逆境胁迫的能力[3-4]，达到提升作物产量和品质的目的。因此，近年来关于SeNPs的人工制备及机理日益成为国内外学者的研究热点。

利用微生物的同化还原、异化还原和甲基化等途径可将土壤、水体、底泥等环境中的无机硒转化为纳米硒[5]。与物理和化学合成方法相比，微生物合成纳米硒是一种环境友好的合成途径，具有转化条件温和、安全性高、环保经济、结构更稳定、分散性好等众多优势[6]。目前，合成纳米硒的微生物主要集中在细菌和真菌中，而关于放线菌的研究较少。放线菌广泛存在于自然界中，许多放线菌作为农用、医药抗生素和生物活性次生代谢产物的重要产生菌，不仅环境适应性强、产孢量大，而且在合成生物纳米硒方面具有潜在的优势[7-8]。昌青青等[9]利用唐德链霉菌(Streptomycestendae)为模板，以Na2SeO3为硒源，在9 mg/L硒条件下富集产生红色圆球状单质硒。崔彬[10]利用放线菌将0.01 μg/mL的Na2SeO3还原为直径100～200 nm的红色单质硒。本课题组前期从陕西省安康市健康花魔芋根际土壤中分离筛选到1株具有富硒能力的菌株A1，其与Na2SeO3作用可以合成红色球形纳米颗粒，该颗粒基本特征与用其他放线菌合成的纳米硒[9-10]类似。本研究即针对菌株A1合成纳米硒的细胞形态特征、物理化学特征(晶型、元素组成和官能团结构等)及抑菌促生活性进行分析，以期为纳米硒生物合成提供新的放线菌菌种资源，同时为菌株A1在富硒花魔芋栽培中的后续应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试菌株 供试放线菌菌株A1是本课题组从安康学院农学大棚健康花魔芋根际土壤中分离获得。

供试靶标菌为花魔芋软腐病原菌菊果胶杆菌(Pectobacteriumchrysanthemi)CZS-B6菌株，由中国典型培养物保藏中心(China Center for Type Culture Collection，CCTCC)(武汉大学)提供。

1.1.2 培养基 采用高氏1号固体培养基[11]进行菌株A1活化、保藏，采用高氏1号液体培养基进行菌株A1发酵滤液的制备；分别采用高氏1号固体培养基、GYM培养基、沙漠菌培养基和ISP2培养基[12]观察菌株A1的基本特征。采用牛肉膏蛋白胨液体培养基培养制备花魔芋软腐病靶标病原菌悬液；采用牛肉膏蛋白胨固体培养基制备用于抑菌活性检测的软腐病靶标病原菌平板。

1.2 试验方法

1.2.1 菌株A1的富硒特性检测 采用红硒法[13]进行富硒特性检测。挑取已活化的菌株A1，分别划线接种在添加10，100，200 mg/L Na2SeO3的高氏1号固体培养基上，28 ℃培养7 d后观察平板上的菌苔是否出现红色，以不添加Na2SeO3的高氏1号固体培养基为对照。

1.2.2 利用菌株A1合成生物纳米硒 按照程丽娟等[11]的方法配制高氏1号液体培养基，将其分装在250 mL三角瓶(100 mL/瓶)中，PE膜封口，121 ℃高压蒸汽灭菌20 min后置于超净工作台上。加入经孔径0.22 μm无菌滤膜过滤的Na2SeO3溶液，使培养基中的Na2SeO3质量浓度达到200 mg/L，对照组不添加Na2SeO3；然后按体积分数5%的量分别接种活化的菌株A1菌液。每处理重复3次，150 r/min、28 ℃恒温培养10 d，可得到菌株A1合成的生物纳米硒。

1.2.3 菌株A1的细胞形态观察与纳米硒基本特性表征 取1.2.2节培养10 d的培养物于50 mL离心管中，4 ℃、10 000 r/min离心10 min，收集的发酵滤液用于种子萌发促生活性和抑菌活性检测，获得的菌体沉淀经冷冻干燥、喷金等处理后，通过扫描电镜(SEM)观察菌株A1的细胞形态及其合成的纳米硒形貌。

取1.2.2节高氏1号液体培养基培养离心收集的菌体沉淀，清洗3次后于-80 ℃下冷藏16 h。经真空冷冻干燥后，利用X射线能谱分析仪(EDS)、X射线衍射仪(XRD)和傅里叶红外变换光谱仪(FTIR)，对菌株A1合成的纳米硒进行物理化学特性表征。X射线衍射分析用Bruker D8 Advance测定，电压40 kV、电流40 mA，Cu靶Kα辐射(λ=0.154 056Å)，步进扫描，步长0.01°，每一步停留时间0.1 s，扫描范围5°～90°。

1.2.4 纳米硒的种子萌发促生活性测定 采用室内培养皿生物测定法检测纳米硒的种子萌发促生活性[14]。供试小麦和玉米种子用体积分数70%酒精表面消毒30 s，无菌水冲洗3次；再用体积分数10% NaOCl表面消毒1 min，无菌水冲洗3次后放入试管中，每试管10粒种子。将1.2.3节离心收集的SeNPs富硒发酵滤液和非富硒发酵滤液分别稀释0(原液)，5和50倍，以无菌水为对照，于25 ℃下避光浸种24 h。弃去浸液，无菌水冲洗种子3次后，放入装有无菌水浸润滤纸的培养皿中，每处理重复3皿，每皿10粒种子，25 ℃恒温培养。以胚根长度达到种子全长的1/2为发芽标准，以7 d内发芽数计算发芽率[15]，发芽率按照以下公式计算：

发芽率=种子发芽终期(前7 d)全部正常发芽种子数/供试种子数×100%。

培养7 d后用直尺测量各处理种子以上部分苗高和主根长，统计正常发芽种子的单株根数，用电子天平称各处理幼苗的总鲜质量。

1.2.5 纳米硒的抑菌活性测定 参照徐炜等[16]的方法制备靶标病原菌悬液，取50 μL菌悬液接种到牛肉膏蛋白胨固体培养基上，涂抹均匀，备用。分别用滤纸片扩散法和牛津杯法测定纳米硒的抑菌活性。

(1)滤纸片扩散法。取1.2.3节制备的菌株A1富硒发酵滤液SeNPs和非富硒发酵滤液(A1)各50 mL，用孔径0.22 μm无菌滤膜过滤，将直径6 mm的灭菌滤纸片放入过滤后的滤液中浸泡10 min，用无菌镊子取出，再放入已接种靶标菌的牛肉膏蛋白胨固体培养基上，每皿四周等距离放4个浸泡的滤纸片，中间以无菌水浸泡的滤纸片作对照[17]。

(2)牛津杯法。在已接种靶标菌的牛肉膏蛋白胨固体培养基上放3个牛津杯，分别取1.2.3节制备的菌株A1的SeNPs富硒发酵滤液和非富硒发酵滤液100 μL，加入2个牛津杯中，另一个牛津杯中加入100 μL无菌水作对照。

以上处理各重复3次，28 ℃恒温培养24 h，观察记录抑菌圈直径。

1.2.6 菌株A1的鉴定 (1)分别在高氏1号固体培养基、GYM培养基、沙漠菌培养基和ISP2培养基[12]上稀释涂布接种菌株A1，28 ℃恒温培养10 d，观察记录菌株A1的菌落形态特征。

(2)按照徐丽华等[18]的方法进行碳源利用、明胶液化、牛奶胨化、硝酸盐还原及H2S、黑色素产生等生理生化特性分析。

(3)采用酶解法[18]提取菌株A1的总DNA，利用细菌16S rDNA通用引物(PA：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，PB：5′-AAGGAGGTG-ATCCAGCCGCA-3′)进行PCR扩增。反应体系为：10×PCR Buffer 2.5 μL，20 mmol/L Mg2+2.0 μL，10 mmol/L dNTP mixture 0.5 μL，3 U/μLTaqPolymerse 0.5 μL，20 μmol/L引物PA和PB各0.5 μL，DNA模板1.0 μL，ddH2O 17.5 μL，总体积25 μL。反应条件：94 ℃预变性4 min;94 ℃变性60 s，58 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，30个循环;最后72 ℃延伸10 min。扩增产物送生工生物工程(上海)股份有限公司测序。采用ClustalX v2.2软件进行同源性分析，Mega 5.0软件中的Neighbor-Joining方法构建系统进化树。

1.3 数据处理

采用SPSS 22.0软件对试验数据进行方差分析，数据用“平均值±标准偏差”表示，以Duncan’s法进行差异显著性检验(P<0.05)。

2 结果与分析

2.1 菌株A1的富硒特性

Na2SeO3作用下菌株A1的富硒特性及合成生物纳米硒SeNPs的扫描电镜观察见图1和图2。

微生物可将培养基中添加的Na2SeO3还原成红色生物硒，使细胞出现红色颗粒沉积[19]，通过红色的深浅和培养基中的含硒量可以判断菌株的富硒能力[9]。由图1-A-D可见，无硒培养条件下菌株A1菌丝呈现白色；在添加10 mg/L Na2SeO3的高氏1号固体培养基平板上，菌株A1菌苔呈现淡红色；在添加100和200 mg/L Na2SeO3的高氏1号固体培养基平板上，菌株A1菌苔呈现深红色，说明含硒条件下菌株A1产生了红色的生物硒。将菌株A1接种到含有200 mg/L Na2SeO3的高氏1号液体培养基中，恒温振荡培养10 d，菌液颜色呈现红色(图1-E)，说明单质硒生成。为进一步确定此结果的准确性，取菌体进行扫描电镜观察，结果见图2。从图2可以看出，培养基中添加200 mg/L Na2SeO3的菌株A1合成了单质球形生物纳米硒。利用X射线能谱分析仪(EDS)对球形颗粒表面元素组成分析结果(图3和表1)表明，在1.4 keV处出现了Se元素的特征峰，其相对含量为15.0%，此外含有部分来自于生物大分子的有机元素，确定菌株A1所产生的球形颗粒为生物纳米硒[20-21]。

表1 菌株A1及其合成生物纳米硒颗粒表面元素的相对含量Table 1 Relative content of strain A1 and its synthesized SeNPs

2.2 SeNPs的物理化学特性表征

从Na2SeO3的衍射谱(图4-A)可以看出，衍射角2θ约为22.01°，37.64°处出现了多个尖锐峰。但经过菌株A1生物转化之后(图4-B)，尖锐峰全部消失，在12.91°，19.62°，29.00°共3个位置出现了较为宽泛的峰，无明显的晶体衍射峰，说明底物Na2SeO3的晶体结构在菌株A1作用下被转化为非晶态的纳米硒。

采用傅里叶红外变换光谱仪对菌株A1合成的生物纳米硒表面官能团结构进行分析，结果(图5)显示，3 259.89 cm-1处存在一个吸收峰，为N-H或O-H伸缩振动，源于纤维素或多糖类物质[22]；在2 914.51 cm-1处存在吸收峰，为C-H伸缩振动，源于脂肪类物质[23]；在1 638.71和1 547.08 cm-1的吸收峰分别对应-CONH-和N-H的伸缩振动，源于蛋白质类物质[24]；1 406.10 cm-1处的吸收峰属于脂肪族的C-H伸缩振动；在1 029.00 cm-1处的吸收峰对应C-O的伸缩振动，源于多糖类物质[25-26]。说明菌株A1在转化Na2SeO3过程中，分泌的多糖类物质为纳米硒颗粒的形成提供了结合位点[27]，且该菌株合成的纳米硒含有脂肪类、蛋白质类有机成分，这些物质的存在使合成纳米硒的稳定性和生物活性增强[6]。

2.3 菌株A1富硒发酵滤液的促生活性

花魔芋有性繁殖器官是实生种子，但由于其休眠期长，出苗率低，难以直接用实生种子及幼苗进行微生物代谢产物促生活性试验[28]。而小麦和玉米种子及其幼苗对微生物代谢产物中的活性物质反应敏感，且易在实验室条件下进行测定，因此其促生活性具有良好的重现性[29-30]。菌株A1发酵滤液对小麦和玉米种子萌发及生长的影响见表2,其表现观察见图6。从表2和图6可以看出，菌株A1的SeNPs富硒发酵滤液原液可促进小麦和玉米幼苗的生长，且对根系生长促进效果尤为明显；其中，小麦和玉米幼苗主根长及总鲜质量均较无菌水对照显著增加(P<0.05)。菌株A1的SeNPs富硒发酵滤液原液对小麦和玉米幼苗单株根数促进作用不明显，但其50倍稀释液处理的小麦和玉米幼苗单株根数分别较无菌水对照显著增加27.1%和56.7%(P<0.05)。

从表2和图6也可看出，菌株A1本身也有一定的促生作用。随着发酵滤液稀释倍数的增大，未添加Na2SeO3的菌株A1发酵滤液对小麦和玉米幼苗生长的促进作用总体呈上升趋势。稀释50倍时，小麦种子发芽率、幼苗苗高和主根长达到最大值，分别较无菌水对照显著增加36.4%，75.0%，65.4%；玉米幼苗主根长和总鲜质量分别较无菌水对照显著增加72.3%，12.7%(P<0.05)。

表2 菌株A1发酵滤液对小麦和玉米种子萌发及生长的影响Table 2 Effect of supernatant synthesized by strain A1 on seed germination and growth of wheat and maize

2.4 菌株A1富硒发酵滤液的抑菌活性

软腐病是我国花魔芋生产中危害最为严重的病害之一，是制约花魔芋种植业发展的重要因素[31]。菌株A1富硒发酵滤液的抑菌活性见图7。

从图7可以看出，菌株A1的SeNPs富硒发酵滤液原液对花魔芋软腐病原菌菊果胶杆菌有明显的抑菌效果。用滤纸片扩散法(图7-A)和牛津杯法(图7-B)测得的平均拮抗圈直径分别为14.6和13.1 mm；但未添加Na2SeO3转化的菌株A1非富硒发酵滤液原液对花魔芋软腐病原菌无抑制作用(图7-C和图7-D)。

2.5 菌株A1的鉴定

2.5.1 培养特征 由图8可以看出，放线菌菌株A1具有典型的链霉菌属特征，在高氏1号固体培养基、GYM培养基、沙漠菌培养基和ISP2培养基上28 ℃恒温培养10 d，均生长良好，菌丝白色至灰白色，边缘放射状，菌落直径0.40～0.55 cm，无可溶性色素产生。

2.5.2 生理生化特性 菌株A1能利用碳源果糖、乳糖、麦芽糖和D-甘露醇，但利用D-木糖、肌醇和山梨醇的能力较差；可使明胶液化，牛奶不凝固不胨化；可产生H2S和黑色素，淀粉水解能力强，纤维素分解能力较弱。菌株A1的碳源利用及生理生化等14项特性与波卓链霉菌(Streptomycesbottropensis)[32-33]吻合。

2.5.3 16S rDNA序列分析 测序结果表明，菌株A1的16S rDNA序列全长1 462 bp(GenBank登录号：OK035202)。调取与菌株A1相似性较高的8株链霉菌属相关典型菌株，用Neighbor-Joining法构建系统进化树，结果(图9)显示，菌株A1与波卓链霉菌(Streptomycesbottropensis)在同一系统进化分支上，相似性为98.3%。

综合16S rDNA序列分析结果及菌落形态、生理生化特性，将菌株A1鉴定为波卓链霉菌。

3 讨论与结论

本研究对所获菌株进行培养特征、生理生化特性及16S rDNA序列分析的结果表明，菌株A1为链霉菌属的波卓链霉菌(Streptomycesbottropensis)。该菌株具有合成生物纳米硒的能力，其富硒发酵滤液有促生效应，对花魔芋软腐病原菌表现出抑菌活性。

目前，国内外对波卓链霉菌有一定的研究。Park等[34]从波卓链霉菌中分离的波卓霉素A2和都奈霉素D3S对水稻白叶枯病菌(Xanthomonasoryzaepv.oryzae)具有抑菌活性。宁楚涵等[32]研究表明，波卓链霉菌能产吲哚乙酸、产铁载体和固氮，并对植物病原菌禾谷镰刀菌(Fusariumgraminearum)、灰葡萄孢(Botrytiscinerea)、立枯丝核菌(Rhizoctoniasolani)和瓜类炭疽菌(Colletotrichumorbiculare)具有不同程度的抑制作用。杜宜新等[33]研究发现，波卓链霉菌对香蕉枯萎病菌(Fusariumoxysporum)、芦笋茎枯病菌(Phomopsisasparagi)、番茄灰霉病菌(Botrytiscinerea)、大豆炭疽病菌(Colletotrichumtruncatum)和玉米大斑病菌(Setosphaeriaturcica)等多种重要的植物病原真菌有较强的抑制作用。本研究发现，波卓链霉菌菌株A1合成纳米硒的发酵滤液对花魔芋软腐病原菌菊果胶杆菌(Pectobacteriumchrysanthemi)有一定的抑制作用，亦能促进小麦和玉米种子萌发及生长，预示着其在软腐病防治和作物促生方面具有较好的应用潜力和开发价值。但其在花魔芋植株上的抑病促生效果有待进一步研究。

目前已报道的具有纳米硒合成能力的微生物主要集中在细菌[35-38]和真菌[39-40]中，而合成纳米硒的放线菌较少，仅有细黄链霉菌(Streptomycesmicroflavus)[41]、比基尼链霉菌(S.bikiniensis)[42]、唐德链霉菌(S.tendae)[9]和其他少数链霉菌属菌株[43]。本试验结果表明，波卓链霉菌菌株A1具有纳米硒合成能力，该结果丰富了合成纳米硒的放线菌种质资源，为纳米红色硒的进一步应用提供了依据。且菌株A1具有分泌胞外多糖、蛋白质、脂肪类等有机分子的能力，这些生物分子对维持纳米硒的稳定性和生物活性至关重要，因此后续还应利用蛋白组学技术，对菌株A1合成的纳米硒生物组分进一步解析。此外，本研究发现生物合成的纳米硒多为非晶态。Ye等[44]以茶多酚、蛋白质和碳水化合物等为原料，通过抗坏血酸-亚硒酸钠氧化还原反应合成的纳米硒也呈非晶态；王丽红等[45]利用嗜酸乳杆菌LA5还原亚硒酸钠也获得非晶态的纳米硒，且非晶态纳米硒反应活性高于晶体形态。由此可知，相比化学合成的晶态纳米硒，菌株A1合成的非晶态纳米硒具有潜在的生物活性优势。