虫螨腈及其代谢物溴代吡咯腈在芥菜上的残留行为与膳食风险评估

孙瑞卿, 王 霞, 任鹏程, 金 静, 李晋栋, 乔雄梧, 秦 曙

(山西农业大学 山西功能农产品检验检测中心，农业农村部农产品质量安全风险评估实验室 (太原)，太原 030031)

虫螨腈 (chlorfenapyr) 作为一种吡咯类化合物，主要作用部位是昆虫体内细胞线粒体，通过抑制二磷酸腺苷(ADP)向三磷酸腺苷(ATP)的转化，从而影响昆虫生命机能所必需能量的形成。该药通过胃毒及触杀作用杀死害虫，且有一定的内吸性，对芥菜夜蛾、小菜蛾、斜纹夜蛾、菜螟、蓟马及菜蚜等多种常见害虫均有良好的防治效果，持效期长且使用安全[1−2]，已获准在我国韭菜、茄子、黄瓜、节瓜、豇豆、豆角、姜、柑橘、苹果、梨、茶以及部分十字花科蔬菜上登记使用[3]，但尚未见其在芥菜上的登记。

农药残留联席会议 (JMPR) 2018 年的评估报告中重新对虫螨腈及其代谢物的毒性进行了评估[4]，认为虽然代谢物溴代吡咯腈占残留物总量的比重较低，但其生物毒性却为虫螨腈的10 倍，因此溴代吡咯腈的膳食风险也不容忽视，故确定虫螨腈的监测定义为虫螨腈，而其风险评估定义为虫螨腈与代谢物溴代吡咯腈的10 倍之和。

目前已有关于虫螨腈在茶叶、姜、大白菜、黄瓜、青菜、猕猴桃等作物上残留行为及风险评估方面的研究报道[5-10]，但同时涉及虫螨腈及其代谢物溴代吡咯腈的研究却较少，仅见孙丰收等[11]建立了同时检测甘蓝中虫螨腈及代谢物溴代吡咯腈残留的分析方法，冯义志等[12]研究了虫螨腈及溴代吡咯腈在菜苔中的消解行为及长期膳食摄入风险，尚未见针对虫螨腈及代谢物溴代吡咯腈在芥菜中残留行为的研究报道，也未见将溴代吡咯腈列入虫螨腈残留物定义进行短期膳食摄入风险评估的研究报道。

本研究遵循《农作物中农药残留试验准则》[13]要求，在我国选择6 个典型的芥菜种植区开展了规范残留试验，分别对虫螨腈及其代谢物溴代吡咯腈在芥菜叶及根中的残留行为进行了研究，同时结合我国人群的膳食消费数据，进行了长期及短期膳食摄入风险评估，旨在评估通过食用芥菜摄入的虫螨腈及溴代吡咯腈残留对我国居民健康的潜在风险，以期为科学合理制定我国关于虫螨腈在芥菜上的残留限量 (MRL) 标准提供依据，同时为该农药在芥菜上的安全合理使用提供建议。

1 材料与方法

1.1 仪器、药剂及试剂

7890B-7010B 三重四级杆气相色谱-串联质谱仪(GC-MS/MS，美国 Agilent 公司)；UPLC IClass XEVO TQ-S Micro 超高效液相色谱-三重四极杆串联质谱仪 (UPLC-MS/MS，美国 Waters 公司)；GM300 刀式研磨仪 (德国 Retsch 公司)；BS210S 万分之一电子天平和TP6101 十分之一电子天平 (赛多利斯科学仪器北京有限公司)；5424R型离心机 (德国 Eppendorf 公司)；Talboys 945066型多管涡旋混合仪 (美国 Troemner 公司)。

虫螨腈 (chlorfenapyr) 标准品 (96.9%，德国Dr.Ehrenstorfer GmbH 公司)；溴代吡咯腈(tralopyril) 标准品 (99.3%，北京曼哈格生物科技有限公司)；100 g/L 虫螨腈悬浮剂 (SC) ，江苏龙灯化学有限公司；N-丙基乙二胺 (PSA) 和石墨化碳黑(GCB) (博纳艾杰尔科技有限公司)。乙腈、甲醇及甲酸为色谱纯，氯化钠和无水硫酸镁为分析纯。

1.2 田间试验

根据产品登记厂家推荐，100 g/L 虫螨腈悬浮剂 (SC) 用于防治十字花科蔬菜上甜菜夜蛾和小菜蛾的使用剂量为有效成分75～105 g/hm2，施药时期为害虫为害的防治适期，每季可使用2 次，间隔期5～7 d，整株喷施，建议安全间隔期为14 d。

于2019 年9 月至2020 年4 月，分别在山西、北京、吉林、河南、安徽和贵州6 地开展了100 g/L虫螨腈悬浮剂在芥菜上的规范残留试验。

最终残留试验：小区面积均为15 m2，设3 次重复，于芥菜收获前31 d 左右施药，施药剂量为推荐最高剂量 (有效成分105 g/hm2)，施药2 次。同时增设对比试验：有效成分105 g/hm2施药3 次；有效成分157.5 g/hm2(1.5 倍最高推荐剂量)施药2 次和3 次。施药间隔期均为5 d。于末次施药后0、10、14、21 d 随机采集至少12 株芥菜叶(≥ 1 kg) 及芥菜根 (≥ 2 kg) 样品。

消解动态试验：地点为北京和山西两地，小区面积均为50 m2，不设重复，于芥菜生长到成熟个体一半大小时施药 (出苗后约30 d)，施药剂量为1.5 倍最高推荐剂量(有效成分157.5 g/hm2)，施药1 次。于施药后2 h 和1、3、5、7、10、14、21、30、45 d 分别采集芥菜叶样品。所有样品均切成1 cm 以下碎块，充分混匀，四分法分取150 g，−20 ℃保存，待测。

1.3 分析方法

1.3.1 仪器检测条件

1.3.1.1 针对虫螨腈的GC-MS/MS 检测

色谱条件：Agilent 19091S-433UI HP-5MS 色谱柱 (30 m × 0.25 mm，0.25 μm)；进样口温度280 ℃，柱温60 ℃持续1 min，以40 ℃/min 升至170 ℃，再以30 ℃/min 升至280 ℃，保持3 min；载气为氦气，流速1 mL/min；进样量1 μL，不分流进样。

质谱条件：EI 离子源，电子轰击源70 eV，离子源温度2 3 0 ℃；G C-M S/M S 接口温度280 ℃；溶剂延迟8 min；碰撞气为氮气。其余质谱参数见表1。

1.3.1.2 针对溴代吡咯腈的UPLC-MS/MS 检测

色谱条件：Waters ACQUITY UPLCR BEH C18色谱柱 (50 m × 2.1 mm，1.7 μm)；流速0.3 mL/min；进样量5 μL；柱温35 ℃。流动相A 相为体积分数0.1% 的甲酸水溶液，B 相为纯甲醇，梯度洗脱程序：0～2.4 min，A 为90%，B 为10%；2.5～3.5 min，A 为2%，B 为98%；3.6～5 min，A 为90%，B 为10%。

质谱条件：电喷雾离子源 (ESI)；正离子扫描；多重反应监测 (MRM) 模式；毛细管电压3500 V；离子源温度400 ℃，脱溶剂气流量800 L/h；碰撞气为氩气，纯度>99.999%；其余质谱参数见表1。

表1 虫螨腈和溴代吡咯腈质谱参数Table 1 MS parameters of chlorfenapyr and tralopyril

1.3.2 样品前处理

提取：称取芥菜叶/根样品5.0 g 于50 mL 离心管中，依次加入乙腈10 mL、氯化钠 5 g，2500 r/min 涡旋振荡提取5 min，8000 r/min 离心5 min，待净化。

净化：取上清液1.5 mL 至装有142.5 mg 无水MgSO4、20 mg PSA 和7.5 mg GCB 的2 mL 净化管中，于2500 r/min 涡旋振荡3 min，6000 r/min离心2 min，过有机滤膜后移取1 mL 上清液，待GC-MS/MS 检测。另取0.5 mL 上清液，加入0.5 mL纯净水，混匀，待UPLC-MS/MS 检测。

1.4 标准溶液配制及标准曲线绘制

用乙腈分别配制1000 μg/mL 的虫螨腈和溴代吡咯腈标准品母液，并用乙腈逐级稀释成100、10 和1 μg/mL 的标准储备溶液；再分别用空白芥菜根、芥菜叶基质溶液稀释标准储备溶液，将虫螨腈配制成0.005、0.02、0.05、0.1、0.2 和0.5 μg/mL 的基质匹配标准工作溶液，进样量1 μL；将溴代吡咯腈配制成0.0025、0.01、0.025、0.05、0.1 和0.3 μg/mL 的基质匹配标准工作溶液，进样量5 μL。以基质匹配标准工作溶液质量浓度为横坐标、对应峰面积为纵坐标绘制标准曲线。

1.5 添加回收试验

分别在空白样品中添加3 个水平的虫螨腈和溴代吡咯腈标准溶液，每个水平重复5 次。虫螨腈添加水平：芥菜根为0.01、0.1 和1 mg/kg，芥菜叶为0.01、0.1 和30 mg/kg；溴代吡咯腈添加水平：芥菜根为0.01、0.05 和0.1 mg/kg，芥菜叶为0.01、0.1 和0.3 mg/kg。按1.3 节所述方法进行样品提取净化及分析测定，计算虫螨腈和溴代吡咯腈的添加回收率及相对标准偏差 (RSD)。

1.6 残留量的计算和表达

根据JMPR 关于虫螨腈在植物中代谢的研究结果，其代谢物溴代吡咯腈的量很低，往往低于分析方法的定量限(LOQ)，因此，在计算其用于暴露评估的残留量时，可作如下处理[4]：1) 如果母体化合物与代谢产物的检测结果均 < LOQ，则以母体化合物的LOQ 值进行评估；2) 如果母体化合物 ≥ LOQ，而代谢产物 < LOQ，则以母体化合物的残留值进行评估；3) 如果母体化合物和代谢产物的检测值均 ≥ LOQ，则以母体化合物加10 倍的代谢产物残留值进行评估。

1.7 长期膳食摄入风险评估

采用国家农药残留标准审评委员会推荐的方法进行膳食摄入风险评估。长期膳食摄入风险计算公式见式(1)和式(2)[14]。

式中：NEDI 指国家估计每日摄入量，mg/kg bw；STMRi为规范残留试验农产品中的农药残留中值，mg/kg；Fi为该可食用农产品的消费量，kg/d。

长期膳食摄入风险用长期暴露风险商 (RQc)表示。

式中：ADI 为每日允许摄入量，mg/kg bw。当RQc≤ 1 时，认为其长期膳食摄入风险可接受；当RQc> 1 时，则表示长期膳食摄入风险不可接受。

鉴于目前仅有虫螨腈和溴代吡咯腈在芥菜一种食用农产品上的残留试验数据，并无在其他登记作物上的STMR 值，因此不能计算其包含所有登记作物在内的膳食暴露NEDI 值，故只计算芥菜中虫螨腈和溴代吡咯腈残留膳食暴露占NEDI的份额以及对RQc的贡献率 (RQc%)。

1.8 短期膳食摄入风险评估

短期膳食摄入风险采用JMPR 推荐的方法，按式(3)和式(4)进行计算[15]。

式中：NESTI 为短期膳食摄入量，mg/kg bw；Ue为单个芥菜的质量，kg；HR 为最高残留量，mg/kg；v为变异因子；LP 为大份额膳食消费量，kg；bw 为消费人群平均体重，kg；ARfD 为短期参考剂量，mg/kg bw。

短期膳食摄入风险以%ARfD 表示。

当%ARfD ≤100%时，认为其短期膳食摄入风险处于可接受水平；当%ARfD > 100%时，则其短期膳食风险不可接受。

2 结果与讨论

2.1 方法有效性评价

虫螨腈及其代谢物溴代吡咯腈在芥菜中的添加回收率和RSD 结果见表2。虫螨腈在0.005～0.5 mg/kg、溴代吡咯腈在0.0025～0.3 mg/kg 范围内，峰面积与质量浓度间呈良好的线性关系，R2>0.99。二者在芥菜叶及芥菜根中的定量限 (LOQ)均为0.01 mg/kg。平均回收率在89%～105%之间，RSD 在1%～4%之间。上述结果均在《农作物中农药残留试验准则》允许的范围内[13]。

表2 虫螨腈和溴代吡咯腈在芥菜中的添加回收率和相对标准偏差Table 2 The recoveries and RSD of chlorfenapyr and tralopyril in mustard

2.2 最终残留结果

100 g/L 虫螨腈悬浮剂以有效成分低剂量(推荐剂量，105 g/hm2)和高剂量(1.5 倍推荐剂量，157.5 g/hm2) 施药2～3 次，6 地的最终残留试验结果 (表3) 显示：芥菜根中虫螨腈的原始沉积量为0.032～0.86 mg/kg，溴代吡咯腈为未检出；芥菜叶中虫螨腈和溴代吡咯腈的原始沉积量分别为1.15～29.56 mg/kg 和 < 0.010～0.38 mg/kg。芥菜根及芥菜叶中虫螨腈母体、代谢物溴代吡咯腈残留量及虫螨腈残留物总量基本上均随着采收间隔期的延长而降低，在芥菜叶中表现尤为明显：14 d时芥菜叶中虫螨腈残留量最高值为22.59 mg/kg，21 d 时降至4.59 mg/kg，下降了约80%。虫螨腈母体及其代谢物在芥菜叶中的最终残留量远高于其在 根中的残留量，其原因可能是因为施药方式为叶面喷施，导致芥菜叶中原始沉积量较高。代谢物溴代吡咯腈在芥菜根及芥菜叶中的残留量占虫螨腈残留物总量的比重均较低。目前，我国、国际食品法典委员会(CAC)、欧盟、美国及日本均未制定虫螨腈在芥菜中的最大残留限量 (MRL) 。

2.3 消解动态

虫螨腈母体在芥菜叶中的消解动态符合一级反应动力学方程，消解曲线见图1，消解动态参数见表4。虫螨腈母体在北京试验点芥菜叶中的消解快于山西试验点，这可能是由于试验期间北京平均气温(13.7 ℃) 高于山西(10.4 ℃)，且总降水量(84.4 mm)也远多于山西(0.8 mm)所致，表明虫螨腈在芥菜叶上的消解与试验期间气温及降水量关系密切。代谢物溴代吡咯腈在芥菜叶中的消解趋势同母体虫螨腈，残留量随采收时间的延长基本呈递减趋势，在山西和北京两地分别于10 d 和14 d 时其消解率已达99.9%以上，但因拟合曲线符合性太差未进行一级反应动力学方程拟合。

表4 虫螨腈母体在芥菜叶中的消解参数Table 4 Dissipation parameters for chlorfenapyr in the mustard leaf

图1 虫螨腈母体在山西 (A) 和北京 (B) 两地芥菜叶中的消解曲线Fig. 1 Digestion curves of chlorfenapyr in mustard leaf in Shanxi (A) and Beijing (B)

2.4 长期膳食摄入风险

虫螨腈的ADI 值为0～0.03 mg/kg bw[16]。当以推荐使用最高剂量 (有效成分105 g/hm2) 施药2 次前提下，距末次施药后14 d，芥菜根和叶中虫螨腈的最终残留中值STMRi(虫螨腈 + 溴代吡咯腈 ×10) 分别为0.056 mg/kg 和1.02 mg/kg。以我国3～5 岁儿童平均体重为17.63 kg[17]、一般人群平均体重为53.23 kg[18]计，结合WHO 用于长期膳食暴露评估推荐的数据源[19]中各年龄段居民不同百分位点的膳食消费量/体重调查数据，计算得到在不同百分位点膳食消费量情况下,芥菜叶中虫螨腈残留对一般人群及3～5 岁儿童长期暴露风险商(RQc)的贡献率，以RQc% 表示 (表5)。由于相关平台中并无与芥菜根相对应的膳食消费数据，因此无法计算芥菜根中虫螨腈残留量对长期膳食摄入风险的贡献率，但鉴于虫螨腈在芥菜根中的残留量相对于芥菜叶很低 (表3)，因此认为芥菜根中虫螨腈残留量对长期膳食风险的贡献率很低，可忽略不计。

表3 芥菜中虫螨腈、溴代吡咯腈及虫螨腈总量(评估定义)的最终残留Table 3 Final residues of chlorfenapyr, tralopyril and total chlorfenapyr (evaluation definition) in mustard

由表5 中数据可看出：对于一般人群和3～5 岁儿童群体，芥菜叶中虫螨腈残留量对风险商的贡献率普遍较低，仅为0.12%～2.47%，且同一消费群体随着消费人群百分位点的增大，RQc%值亦增大。一般人群通过摄入芥菜叶中虫螨腈残留，在50%、95%和97.5% 位点处的RQc% 值分别为0.12%、0.40%和0.49%；3～5 岁儿童通过摄入芥菜叶中虫螨腈残留，在50%、95%和97.5%位点处的RQc%值均高于一般人群，分别为0.64%、2.03%和2.47%。综合考虑后认为，运用97.5% 位点处的膳食统计数据更符合风险评估要求，且因为儿童的膳食摄入特点有别于一般人群或成年人，因此根据国际膳食暴露评估 (如WHO 推荐的JMPR 农药残留膳食暴露评估) 惯例，可用3～5 岁年龄组的评估结果代表对儿童消费群体的膳食风险。

表5 芥菜叶中虫螨腈残留的长期膳食摄入风险评估结果[19]Table 5 The results of long-term dietary intake risk assessment of chlorfenapyr in mustard leaf[19]

2.5 短期膳食摄入风险

虫螨腈的ARfD 值为0.03 mg/kg bw[19]。根据WHO GEMS/FOOD (全球环境监测系统/食品污染监测与评估规划) 2017 年公布的数据[18]，我国1～6岁儿童的芥菜叶大份额膳食消费量 (LP) 为299.31 g，一般人群的LP 为554.45 g，单个芥菜的质量(Ue)为245 g，变异因子(v)选定为3，我国1～6 岁儿童的平均体重为16.14 kg，一般人群平均体重为53.23 kg，则芥菜叶中虫螨腈 (总量) 在4 种不同情景下的最终残留试验最高值 (HR，虫螨腈 + 溴代吡咯腈 × 10) 见表6。根据公式 (3) 和公式 (4) 计算得芥菜叶中虫螨腈残留对我国1～6 岁儿童及一般人群的短期膳食暴露风险。由于IESTI 估算表中并无与芥菜根相对应的膳食消费数据，因此无法进行虫螨腈在芥菜根中残留的短期膳食风险评估。

参考膳食摄入风险评估的基本原则，%ARfD越大意味着该农药的摄入风险越大。由表6 可看出，在情景1 (推荐使用最高剂量) 前提下，芥菜叶中虫螨腈残留对我国1～6 岁儿童及一般人群的%ARfD 值分别为1299%和521%。增加施药剂量和施药次数将直接导致HR 值增大，从而使虫螨腈对我国1～6 岁儿童及一般人群的%ARfD值增大，例如情景2 前提下的%ARfD 值分别为1715%和688%，情景3 前提下的%ARfD 值分别为1725%和692%。情景4 (推迟采收间隔期至21 d)，与情景1 的%ARfD 值相比，随着HR 值的减小，芥菜叶中虫螨腈残留对我国1～6 岁儿童及一般人群的%ARfD 值均有所降低。

表6 虫螨腈的短期膳食摄入风险评估结果Table 6 The results of short-term dietary intake risk assessment of chlorfenapyr

4 种情景下，芥菜叶中虫螨腈残留对我国1～6 岁儿童及一般人群均存在较高的短期膳食摄入风险，且对1～6 岁儿童的风险远高于对一般人群的风险，%ARfD 值约为普通人群的3 倍。本团队前期研究显示，规范残留试验前提下，白菜中的虫螨腈残留对我国1～6 岁儿童及一般人群同样也存在明显的短期膳食摄入风险，%ARfD 值分别为940%和520%[20]。

3 结论

1) 本研究建立了快速、简便的检测芥菜叶和根中虫螨腈及代谢物溴代吡咯腈残留的分析方法。样品经乙腈提取，分散固相萃取净化后，采用GC-MS/MS 检测虫螨腈、UPLC-MS/MS 检测溴代吡咯腈，并运用该方法进行了试验样品的残留量测定。

2) 最终残留和消解动态试验结果表明：虫螨腈母体及其代谢物溴代吡咯腈在芥菜叶中的最终残留量均远高于其在根中的残留量，这可能与施药方式为叶面喷施有关，且残留量基本随采收时间的延长呈递减趋势；虫螨腈在芥菜叶中的消解半衰期为4.2～5.9 d，属易降解农药；溴代吡咯腈在芥菜叶中的消解动态拟合曲线符合性差，未能计算其半衰期，在山西和北京两地分别于10 d和14 d 时其消解率已达99.9%以上。

3) 100 g/L 虫螨腈悬浮剂以推荐使用最高剂量(有效成分105 g/hm2) 施药2 次，施药间隔期为5 d，采收间隔期为14 d，长期及短期膳食摄入风险评估结果表明：芥菜叶中虫螨腈残留对我国一般人群和3～5 岁儿童的长期膳食暴露风险商的贡献率均较低，对我国1～6 岁儿童及一般人群均存在不可接受的短期膳食摄入风险，但加工后芥菜叶中虫螨腈的降解规律还有待进一步研究，以最终明确其短期膳食摄入风险是否可接受。

4) 本研究采用推荐使用最高剂量(105 g/hm2)、施药2 次、间隔5 d、安全采收间隔期14 d 的残留量数据进行长期及短期膳食摄入风险评估，认为是遵从了良好农业规范前提下的最糟(worst case)方式，适用于制定农药MRL 标准时进行的长期及短期膳食风险评估。若选择157.5 g/hm2或施药3 次情况下的残留数据进行评估，将使最终残留试验的HR 值和STMR 值增大，直接导致推荐的MRL值偏高，有可能在一定程度上降低MRL 标准对居民安全膳食的保护水平。

5) 目前我国在制定农药MRL 标准时，尽管采用了规范残留试验数据，但是并未将短期膳食摄入风险评估纳入考量范围，而从本研究的评估结果可以看出，即使残留量未超标也仍可能存在不可接受的短期膳食摄入风险。因此建议我国在进行农药登记及制订、修订食品中农药MRL 标准时，不仅要进行长期膳食摄入风险评估，针对一些有短期膳食摄入考量 (即已制定ARfD 值) 的农药，还应同时考虑其短期膳食摄入风险[21]。

6) 随着采收时间的延长，芥菜叶中残留虫螨腈的短期膳食摄入风险有所降低，因此，对于短期膳食摄入风险较高的农药，应适当延长其安全采收间隔期，以降低农药残留量，保证对各类人群的短期膳食摄入风险均在可接受范围内。同时1～6 岁儿童因平均体重较轻，造成其短期膳食摄入风险远高于一般人群，因此在制定MRL 标准时应充分考虑对此类人群的保护水平。

7) 本研究参照JMPR 制定的ARfD 值进行短期膳食暴露评估，膳食消费数据来自WHO GEMS/FOOD 中关于我国人群的消费数据。评估人群通常分为3 大类：1～6 岁儿童、一般人群和育龄妇女，其中1～6 岁儿童的膳食结构实际存在很大差异，将1～6 岁儿童的暴露参数统一划为一个水平，容易过高估计对1～2 岁低龄儿童的短期膳食摄入风险。因此，建议相关部门应尽快建立并完善我国的短期膳食暴露评估方法体系及针对不同人群、不同食物的短期膳食消费量数据库，并充分考虑低龄幼儿的膳食特殊性，将膳食消费数据细化至儿童生长期的不同阶段，从而为保障我国居民的膳食安全提供更加详尽的基础数据。