应用同位素标记相对和绝对定量蛋白质组学方法筛选浆细胞性乳腺炎病人差异表达蛋白质

陈波 赵侃侃 卢文亮 郑媛

浆细胞性乳腺炎(plasma cell mastitis,PCM)又称导管周围炎或导管扩张症，常发生于非哺乳期妇女,其发病机制目前仍未完全明确[1-2],其临床表现复杂多样，易反复，临床误诊率较高，治疗难度较大，国内外尚无统一的诊疗指南。探索PCM的发病机制和病理生理过程对治疗具有重要意义。同位素标记相对和绝对定量(isobaric tags for relative and absolute quantitation,iTRAQ)是近年来定量蛋白质组学常用的高通量筛选技术，标记效率高、标记过程简单、灵敏度高、适用范围广[3]。本研究应用iTRAQ定量蛋白质组学方法，探索PCM组织的蛋白谱，并通过生物信息学分析，筛选差异蛋白、进行功能富集分析，研究差异蛋白可能的功能，初步鉴定出在PCM发生、发展中的关键分子。报道如下。

对象与方法

一、对象

PCM病人病灶组织(4例)和对应的邻近正常组织(对照组)均来自湖北省妇幼保健院甲乳外科进行手术治疗的病人。均经过病理检查证实为PCM。

二、方法

1.蛋白提取：对4例PCM病人的病灶组织及病灶旁正常组织样本用遇冷的PBS清洗，冰浴超声5分钟，离心后取上清，加等体积的100%乙腈溶液，混合均匀，冰上放置1小时;沉淀完成后离心，取上清液，冷冻收干至体积缩小一半后，用预先润湿的10 KD超滤管10 000 g，4 ℃离心，再用200 μl超纯水重复上述操作。收集穿透液，加入1%的甲酸调pH至2～3。取2 μl蛋白样品，稀释到合适倍数，用Bradford法测定蛋白浓度。

2.iTRAQ标记和分级分离：取酶解除盐后的肽段，根据iTRAQ-8标试剂盒(SCIEX)说明书进行标记，样本标记后混合，然后将混合后的肽段运用Ultimate 3000 HPLC系统(Thermo DINOEX,USA)对肽段样品进行分级分离。

3.LC-MS/MS分析：分离后的肽段样品，使用与EKsigent nanoLC系统(AB SCIEX,USA)偶联的Triple TOF 5600 plus质谱仪进行分析。本研究使用的是武汉金瑞开有限公司蛋白质组学技术平台。质谱下机数据利用Protein Pilot 4.5软件进行数据库检索分析。

4.生物信息学分析：对蛋白质鉴定的基本流程为选出可信蛋白，根据分析模式组合数据，选出可分析蛋白，选出差异蛋白。本研究中，PCM差异蛋白标准为：adj.P-value≤ 0.05情况下，差异倍数≥2.0(表达上调)或差异倍数≤0.50(表达下调)。差异蛋白的功能富集分析采用GO和KEGG进行注释。基因本体论(Gene Ontology,GO)是一个国际标准化的基因功能分类体系，包括分子功能(molecular function)，细胞组分(cellular component)，生物学过程(biological process)。京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)是有关通路的主要公共数据库。通过KEGG分析，能确定蛋白质参与的最主要生化代谢途径和信号转导途径。

结果

1.iTRAQ蛋白质组学技术筛选的PCM中差异表达的蛋白：应用iTRAQ蛋白质组学技术对PCM组织和正常组织进行蛋白组学分析，见图1。根据预先设置的差异蛋白的标准，在PCM中，915个蛋白表达量发生显著变化(上调795个蛋白，下调120个蛋白)。差异最显著的10种蛋白，以及这些蛋白的功能见表1。

表1 PCM与对照组织排名前10的差异表达蛋白及功能富集分析

图1 PCM与对照组织差异表达蛋白火山图

2.差异蛋白功能富集分析结果：在PCM中差异表达的蛋白质主要功能见图2。这些差异表达的蛋白质主要参与的生物学过程包括细胞细胞黏附、糖酵解、翻译起始、调控炎症反应、对真菌的防疫反应、细胞氧化还原稳态等过程。这些差异蛋白主要参与形成的细胞学组分包括细胞外泌体，细胞外基质、细胞质、细胞膜、线粒体等。这些差异蛋白质的主要功能包括结合RNA，介导细胞细胞黏附、结合蛋白激酶、结合MHC Ⅱ类蛋白复合物等。

图2 差异蛋白GO富集分析

3.差异蛋白KEGG通路富集结果：在PCM中差异表达的蛋白质主要参与的信号通路见图3。其中，代谢通路中，差异蛋白主要参与碳水化合物代谢通路、脂质代谢通路、能量代谢通路等。此外，差异蛋白还参与信号转导、细胞增殖和死亡、免疫系统、内分泌系统、感染性疾病、肿瘤、免疫性疾病等信号通路。

图3 差异蛋白KEGG分析

讨论

PCM的病因未明，病程较长，临床表现复杂多样，极易错过最佳治疗时机，部分病人最后不得不行乳房切除[4]。给病人身心健康造成造成严重影响。因此，从蛋白质组学层面探索影响PCM病理生理的关键分子具有重要意义。本研究通过iTRAQ定量蛋白质组学方法筛选到915个差异表达蛋白，并通过生物信息学的方法分析了这些差异蛋白可能的功能和信号通路。

有研究表明，PCM与自身免疫系统功能紊乱有关[5-10]。PCM的病理基础是由多种原因引起的乳腺导管扩张，导管上皮细胞破坏、脱落，角化的碎屑和脂质分泌物堵塞管腔，从而刺激乳腺导管壁周围产生炎症反应，浆细胞、中性粒细胞、淋巴细胞及泡沫细胞等慢性炎性细胞浸润[8]。我们的研究支持上述研究结论。在PCM中，KEGG通路分析表明我们筛选到的差异蛋白主要参与免疫系统相关通路。蛋白结构域分析也表明这些差异蛋白主要富集在免疫球蛋白结构域。因此，免疫系统功能与PCM的发生、发展值得进一步的研究。此外，我们的研究发现这些差异蛋白参与感染性疾病(细菌，病毒和寄生虫)相关通路。关于PCM与感染的关系，存在很大争议。有研究在PCM病人组织中培养出多种类型的细菌、真菌以及分枝杆菌[11-13]。也有研究表明，PCM组织中细菌检出率和正常对照组织无明显差异[14]。本研究结果表明，在PCM组织中差异表达的蛋白质显著富集在感染性疾病相关通路。说明感染在PCM的发生发展中起一定的作用。

本研究样本量偏小是其局限性。通过蛋白质组学技术分析PCM蛋白表达谱，筛选出了一些关键作用的分子，为后续缩小研究范围提供了参考。