慢性盆腔炎模型大鼠中miR-224-3P及TGF-β/Smads信号通路相关分子的表达水平与子宫组织炎症相关性*

2022-06-13杨丽红王娟娟丁向辉吉玉洁

解剖学杂志 2022年2期

杨丽红王娟娟丁向辉吉玉洁

（中国人民解放军陆军第八十一集团军医院，张家口 075000）

慢性盆腔炎是女性内生殖器及其周围结缔组织、盆腔腹膜的慢性炎症，常为急性盆腔炎未彻底治疗，或急性盆腔炎的病程迁延及反复发作。转化生长因子-β（transforming growth factor，TGF-β）和Smad蛋白（drosophila mothers against decapentaplegic protein，Smad）参与了盆腔炎的发生发展，是盆腔炎调控的重要分子[1]。miRNAs在真核生物中表达具有组织特异性和时序性，决定组织和细胞的功能特异性，在细胞生长和机体发育调节过程中起多种作用，研究表明miR-224与组织炎症具有显著的调控关系，并可通过TGF-β/Smad信号通路调控动脉粥样硬化斑块和血管重塑，但miR-224在盆腔炎中的作用及机制尚不清晰[2]。因此本研究将通过机械损伤及接种混合菌构建大鼠慢性盆腔炎模型，探究miR-224-3P及TGF-β/Smads信号通路在慢性盆腔炎模型大鼠模型表达及相关性。

1 材料和方法

1.1 动物

8～10周龄雌性SPF级SD大鼠，由北京维通利华实验动物中心提供。

1.2 药品、试剂

水合氯醛购自天津市申泰化学试剂有限公司；混合菌液购自无锡赛维科技公司；Rat TNF-α ELISA Kit（RAB0479），购于美国Sigma公司，Rat NF-κB ELISA Kit（201803）购于惠佳生物科技有限公司；逆转录试剂盒（6110A）购于日本TaKaRa公司；荧光定量PCR试剂盒（RT0411-01）购于美国Biomiga公司；引物由上海生工合成；TGF-β（ab205150）、Smad3 （ab40854），Smad3（ab40854）和二抗（ab150113）抗体购于美国Abcam公司。

1.3 大鼠分组及饲养条件

40只8～10周龄雌性SD大鼠于SPF级鼠房饲养，室温调节在25℃±2℃，相对湿度40%～65%，12 h/12 h昼夜交替照明，自由摄取食物和饮用水。适应性饲养1周后，随机分为2组，每组20只。

1.4 大鼠慢性盆腔炎模型的建立

大鼠称重后按0.4 mL/100 g 10%水合氯醛行腹腔注射麻醉。菌液配置：金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、乙型溶血型链球菌，按照1∶2∶1混合，用0.9%的NaCl配置终浓度为2×109/mL菌液混合液。用水合氯醛麻醉大鼠后，将大鼠固定，无菌条件下腹部中央切1 cm切口，固定并暴露大鼠双侧子宫，机械损伤子宫内膜组织，并分别向双侧子宫腔注入0.1 mL混合菌液，建立慢性盆腔炎模型[3]。

1.5 采血方式及ELISA检测

大鼠采用毛细管眼眶采血，每只大鼠取1 mL。用大鼠肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor，TNF-α）、核因子κB（nuclear factor κB，NFκB） ELISA检测试剂盒，检测血清样本中TNF-α、NF-κB含量水平，每组设置3个复孔，操作步骤严格按照说明书进行[4]。

1.6 qPCR检测

大鼠眼眶取血后取子宫组织，用TRIzol法提取总mRNA，并立刻反转录，所有操作在冰上进行并避免RNA酶污染，反转录后进行qPCR分析，相对表达量采用2-△△CT计算[5]。miR-29c-3p引物，F：GCTGGTTTCATATGGTGG，R：GAACATG TCTGCGTATCTC。TGF-β引物，F：AGCAACAAT TCCTGGCGTTACCT，R：CCTGTATTCCGTCTCC TTGGTTCA。Smad3引物，F：GAAGTCCTCGGA ACTGCCTACCT，R：ACTGTGCCATAGTCACC TGGAAGA。β-actin引物，F：GAGACCTTCAACA CCCCAGCC，R：AATGTCACGCACGAT TTCCC。

1.7 免疫印迹检测

采用RIPA蛋白裂解液提取大鼠子宫组织细胞总蛋白，进行SDS-PAGE 电泳80 v 15 min，120 v 2 h，PVDF膜转膜120 v 2.5 h，TBST 漂洗3次，使用5%脱脂奶粉封闭，TBST漂洗3次每次10 min，加入一抗、二抗孵育后，TBST漂洗3次，每次10 min，ECL 显色，发光仪曝光、拍照[6]。

1.8 统计学处理

采用 SPSS 22.0软件进行统计学分析，实验独立重复3次，计量资料以±s表示，t检验，相关性采用双因素方差分析，P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 慢性盆腔炎大鼠模型构建及其子宫炎症水平的组织学评价

对照组大鼠宫腔正常，宫壁组织结构清晰，上皮细胞整齐排列，各层无充血血管，炎症细胞无浸润。实验组宫壁组织结构不清晰，各层分界不明显，上皮细胞变性，可见炎性细胞浸润；子宫平滑肌纤维组织增生、粘连，间质充血、水肿，出现典型的慢性盆腔炎表征（图1）。

图1 大鼠子宫（A1、B1）及H-E染色（A2、B2）

2.2 慢性盆腔炎大鼠外周血炎症因子的表达水平变化

ELISA结果显示盆腔炎组大鼠外周血TNF-α与NF-κB水平显著高于对照组，差异具有统计学意义（P＜0.05，P＜0.01）（表1）。

表1 慢性盆腔炎对大鼠血浆炎症因子的影响（±s，pg/mL）

*P＜0.05，**P＜0.01 vs 对照组

组别 TNF-α NF-κB对照组 107.08±11.48 87.54±9.43实验组 113.06±8.65* 103.62±3.91**

2.3 慢性盆腔炎大鼠子宫组织中miR-224-3P，TGF-β和Smad3的mRNA表达水平

与对照组相比，实验组大鼠miR-224-3P表达水平显著下降，TGF-β和Smad3 mRNA表达水平显著上升（P＜0.05），miR-224-3P与TGF-β mRNA呈显著正相关（r=0.867，P＜0.01），miR-224-3P与Smad3 mRNA呈显著正相关（r=0.826，P＜0.01）（表2）。

表2 慢性盆腔炎大鼠子宫组织miR-224-3P、TGF-β和Smad3 mRNA的表达（±s）

*P＜0.05，**P＜0.01 vs对照组

组别 miR-224-3P TGF-β mRNA Smad3 mRNA对照组 2.05±0.62 1.34±0.30 0.98±0.06实验组 2.89±0.36* 2.04±0.51** 2.03±0.69**

2.4 慢性盆腔炎大鼠子宫组织TGF-β、Smad3及p-Smad3的蛋白表达水平

与对照组相比，实验组大鼠子宫组织TGF-β、Smad3和p-Smad3的蛋白表达水平显著上升，相对定量结果进一步证实这种趋势，差异具有统计学意义（P＜0.01）（图2）。

图2 大鼠子宫组织TGF-β、Smad3及p-Smad3的蛋白表达水平比较

3 讨论

盆腔炎性是女性上生殖道的一组感染性疾病，其中包括子宫内膜炎、输卵管炎、输卵管卵巢脓肿、盆腔腹膜炎[7]。盆腔炎症时可表现为局部一个部位，也可表现为同时累及几个部位，以输卵管炎、卵巢炎最为常见。盆腔炎性疾病在初潮前、无性生活和绝经后妇女很少发生，即使发生也常常是邻近器官炎症的扩散，而在性活跃期、有月经的妇女中盆腔炎性疾病高发，盆腔炎性疾病若未能得到及时、彻底治疗，可导致输卵管妊娠、慢性盆腔痛、炎性反复发作，甚至不孕，严重影响妇女的生殖健康[8-10]。本研究通过机械损伤及接种混合菌构建大鼠慢性盆腔炎模型，分离大鼠附件组织，发现盆腔炎大鼠子宫组织明显慢性炎症表征，子宫组织出现出血、黏连等恶性病变，腺体明显减少，子宫平滑肌纤维组织增生、粘连，上皮细胞变性、脱落、坏死，宫内膜缺失，可见炎性细胞浸润。

非编码RNA（non-coding RNA）是指不编码蛋白质的RNA。其中包括rRNA、tRNA、snRNA，snoRNA 和microRNA 等多种已知功能的RNA，以及未知功能的RNA[11]。这些RNA的共同特点是都能从基因组上转录而来，但并不转录翻译成蛋白质，在RNA调控水平上就能行使各自的生物学功能。microRNAs （miRNAs）是小型、高度保守的RNA分子，通过与它们的碱基配对调节其同源mRNA的表达，已成为发育、细胞增殖、分化和细胞周期的重要调控分子[12]。本研究结果显示盆腔炎大鼠中miR-224-3P显著下调，并且与TGF-β/Smads信号通路呈现显著的正相关，提示miR-224-3P、TGF-β/Smads信号通路在慢性盆腔炎发病中发挥重要作用。

TGF-β主要在炎症、组织修复和胚胎发育等方面发挥作用，但对细胞的生长、分化和免疫功能也都有重要的调节作用[13]。Smads家族蛋白可以在将TGF-β信号从细胞表面受体传导至细胞核的过程中起到关键性作用，且不同的Smad介导不同的TGF-β家族成员的信号转导。TGF-β作为配体形成的受体复合物，激活Smads进入核内，共同激活或抑制它们调节的靶基因的转录[16]。本研究结果表明，在大鼠慢性盆腔炎过程中，TGF-β、Smad3在转录和蛋白水平均出现了高表达的变化，同时p-Smad3表达也随之上升，提示miR-224-3P在慢性盆腔炎中发挥作用可能与TGF-β、Smad3通路的磷酸化相关。

综上，本研究表明慢性盆腔炎模型大鼠子宫组织中miR-224-3P表达与TGF-β、Smad3呈显著正相关，其机制可能与TGF-β/Smad3信号通路的磷酸化相关。