橙皮素纳米粒对大鼠糖尿病心肌病的预防作用

叶若雷 蔡征远 骆松梅

（丽水市中心医院药学部，丽水 323000）

糖尿病心肌病（diabetic cardiomyopathy，DCM）是导致糖尿病患者心衰的首要危险因素[1]。DCM是独立于冠心病以及高血压以外，由于长期代谢障碍引起的心血管功能异常，且目前尚缺乏有效的防治方法[2]。研究显示，DCM的病理生理学机制十分复杂，包括氧化应激损伤、炎症反应、线粒体损伤及心肌细胞凋亡等在内的多种致病因素与DCM的发生及发展密切相关[3]。橙皮素（hesperetin，HSP）是一种在柑橘类果皮中发现的一种黄酮苷，具有抗炎、抗氧化及血管保护等生物活性[4-6]。体外细胞实验证实，HSP能够通过线粒体相关的抗凋亡途径改善脂多糖诱导H9C2心肌细胞的凋亡[7]。但是由于HSP溶解度低、稳定性差导致其在体应用生物利用度低，限制了其临床应用[8]。纳米粒是一种粒径介于10～1 000 nm的新型药物递送载体[9]。应用纳米粒包载难溶性药物能够显著提高药物溶解度、稳定性及生物利用度[10]，有望解决难溶性药物在体应用的药动学缺陷。本研究拟制备包载HSP的新型纳米粒，并将其在体应用探讨HSP纳米粒对预防糖尿病大鼠心肌病的效果及其作用机制。

1 材料和方法

1.1 实验材料

健康清洁级雄性Sprague Dawley（SD）大鼠60只，体质量190～210 g，鼠龄约40～50 d，购自上海斯莱克实验动物有限公司，实验动物生产许可证号：SYXK（浙）2015-0001，质量合格证号：wydw2013-0050。饲养于SPF动物房：室内温度22℃±2℃，湿度保持在45%～55%，12 h循环照明，自由摄食和饮水。

HSP批号YK0827B2812J，购自日本东京化成工业株式会社，纯度≥99%；聚ε-己内酯（PCL，平均分子量8万，深圳市光华伟业实业有限公司，批号10032003GT）；山梨醇单硬脂酸酯（Span-60，河南正通化工有限公司，批号20150210）；吐温-80（湖南尔康制药股份有限公司，批号20140501）；辛酸/酸/癸酸甘油三酯（北京凤礼精求商贸有限公司，批号120411）；链脲佐菌素（STZ，美国Sigma公司，批号S0160）；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）测定试剂盒（批号20160311），丙二醛（malondialdehyde，MDA）测定试剂盒（批号20160501）及谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）试剂盒（批 号20170319）均购自南京建成生物工程研究所；H-E染色试剂盒（北京索莱宝科技有限公司，批号20180525）；RIPA裂解液（上海碧云天生物技术有限公司，批号P0013B）；BCA试剂盒（北京索莱宝科技有限公司，批号20140722），兔抗鼠B淋巴细胞瘤-2蛋白（Bcl-2，批号15071S）、半胱氨酸蛋白酶-3（caspase-3，批号19677S）及Bcl相关X蛋白（Bax，批号5023S）一抗均购自美国CST公司。

1.2 HSP纳米粒的制备及其质量考察

参考Jornada等[11]橙皮素纳米粒的制备方法制备载药纳米粒，方法简述如下：将处方量聚ε-己内酯（PCL，0.1 g），山梨醇单硬脂酸酯（Span-60，0.038 g），辛酸/癸酸甘油三酯（0.165 mL）及HSP（0.005 g）加入到适量丙酮中水浴加热40℃，磁力搅拌条件下充分溶解作为有机相。另取吐温80（0.077 g）加入到50 mL双蒸水中充分混匀作为水相。然后在40℃水浴及磁力搅拌条件下缓慢将上述有机相溶液注入到水相中形成HSP纳米粒混悬液，室温搅拌10 min，40℃减压旋转蒸发除去有机溶剂即得包载HSP纳米粒溶液。

应用透射电镜观察HSP纳米粒的微观形态。同时应用马尔文激光粒度分析仪（Mastersizer 2000，英国）测定载药纳米粒的粒径分布及Zeta电位。包封率的测定采用超速离心法，精密量取1.00 mL上述载药纳米粒溶液，7 280×g离心10 min后，取上清液稀释后应用HPLC法（岛津LC-20A型高效液相仪）测定上清液中HSP药物含量。色谱柱：4.6×150 mm2。色谱条件：流动相，乙腈∶水∶0.1%乙酸体积比50∶49∶1，流速1.0 mL/min，检测波长290 nm。

1.3 Ⅰ型糖尿病大鼠实验模型建立及实验分组

参考Zhang等[12]大鼠Ⅰ型糖尿病建模方法，采用腹腔注射STZ建立大鼠Ⅰ型糖尿病模型。随机选取15只SD大鼠作为正常组，其余大鼠单次腹腔注射70 mg/kg STZ 建立Ⅰ型糖尿病模型，正常组大鼠给予等剂量PBS溶液。分别于STZ注射后第3、7、14天尾静脉采血测定空腹血糖。大鼠空腹血糖值＞250 mg/dL，且明显表现为多饮、多食及体质量减轻等症状即为Ⅰ型糖尿病模型建模成功。将实验大鼠随机分成正常对照组、糖尿病模型组（DM组）、HSP溶液组及HSP纳米粒组，HSP溶液组及HSP纳米粒组腹腔注射20 mg/kg HSP溶液或者HSP纳米粒包括HSP 20 mg/kg，正常组及糖尿病模型组大鼠给予等剂量生理盐水，所有治疗形式每周干预2次，连续干预16周。

1.4 常规超声检查评价大鼠心功能

药物干预结束后，应用常规超声心动图检查大鼠心功能。将大鼠吸入式麻醉，仰卧位固定，褪去前胸毛发，行超声心动图测量各组大鼠左室收缩末期内径（(left ventricular end systolic diameter，LVESD）、左室舒张末期内径（left ventricular end diastolic diameter，LVEDD）、左心室射血分数（left ventricular ejection fraction，LVEF）、舒张早期与舒张晚期最大运动速度比值（ratio of early and late diastolic tissue peak velocity of mitral annulus，Em/Am）及左室短轴缩短率（left ventricular fractional shortening，LVFS）。每只大鼠至少观察3个连续的心动周期，计算其平均值。

1.5 H-E染色观察心肌组织病理形态变化

超声心功能检查后处死大鼠，取左心室心肌组织，10%福尔马林溶液中固定，脱水，石蜡包埋，切片，片厚4 μm，H-E染色，光学显微镜下观察心肌组织形态学变化。

1.6 心肌组织SOD、MDA及GSH-px水平测定

另取部分心肌组织，用生理盐水洗净后制成10%心肌组织匀浆液，严格按照ELISA试剂盒说明书操作测定心肌组织SOD、MDA及GSH-Px含量，评价各组大鼠的氧化应激水平。

1.7 免疫印迹检测心肌组织Bcl-2、caspase-3及Bax蛋白表达

将大鼠心肌组织剪碎后研磨，RIPA裂解缓冲液提取左心室组织蛋白，BCA试剂盒测定蛋白浓度后，加缓冲液煮沸使蛋白变性，随后进行SDSPAGE凝胶电泳分离并转至PVDF膜，室温封闭2～3 h。加入兔抗大鼠caspase-3、Bcl-2、Bax一抗（1：1 000）稀释液，4℃摇床孵育过夜。洗液冲洗3次，每次10 min，再用辣根过氧化酶结合的二抗室温孵育2 h，滴加发光液曝光。β-actin为内参。

1.8 统计学处理

采用SPSS 17.0软件进行统计学分析，计量数据以±s表示，两两比较采用方差齐性检验、t检验；多组间比较采用方差分析，两组间均数比较采用LSD-t法检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HSP纳米粒的质量表征

透射电镜结果显示HSP纳米粒的微观形态呈椭球形（图1A），分散均匀，粒径在150 nm左右。载药纳米粒的粒径分布均匀（图1B），平均粒径为（161.34±9.71）nm。HSP纳米粒的Zeta电位值为（-14.5±0.9）mV。载药纳米粒包封率为（91.23±5.23）%。

图1 橙皮素纳米粒透射电镜下形态（A）及粒径分布（B），标尺=200 nm

2.2 各组大鼠心功能比较

与正常对照组比较，DM组大鼠LVESD、LVEDD值显著升高，LVEF、E/A和LVFS值 显著降低；和HSP溶液组比较，HSP纳米粒组的LVESD、LVEDD值显著降低，同时LVEF、E/A和LVFS值显著升高，以上差异均有统计学意义（P＜0.05）（表1）。

表1 各组大鼠心功能指标比较（n=15，±s）

表1 各组大鼠心功能指标比较（n=15，±s）

*P＜0.05 vs正常对照组；△P＜0.05 vs DM组；#P＜0.05 vs HSP溶液组

组别 LVESD（mm） LVEDD（mm） LVEF（%） E/A LVFS（%）正常对照组 3.98±0.41 6.38±0.26 80.78±8.78 1.47±0.27 60.76±6.14 DM组 5.79±0.67 8.47±0.25* 63.12±6.93* 0.73±0.14* 43.28±6.41*HSP溶液组 4.86±0.28 7.73±0.42△ 71.13±3.12△ 1.01±0.23b 48.56±6.32△HSP纳米粒组 4.12±0.24 7.14±0.50△# 76.86±4.51△# 1.32±0.11△# 53.34±3.71△#

2.3 各组大鼠心肌组织形态结构比较

正常对照组大鼠心肌细胞排列整齐、致密，结构清晰，染色均匀，细胞外间质较少（图2A）；与正常对照组相比，DM组大鼠心肌细胞间隙增大，有明显的心肌纤维损伤和断裂，心肌细胞排列紊乱（图2B）。与DM组相比，HSP溶液组及HSP纳米粒组大鼠心肌组织大体完整，细胞排列较规则，细胞间隙明显减少，心肌组织损伤改善较明显（图2C）。尤其是HSP纳米粒组，心肌细胞排列规则，心肌纤维结构清晰，心肌组织完整，接近正常对照组水平（图2D）。

图2 各组大鼠心肌组织形态学比较，H-E染色，标尺=50 μm

2.4 各组大鼠心肌组织SOD、GSH-Px、MDA含量比较

与正常对照组比较，DM组大鼠心肌组织SOD、GSH-Px含量显著下降，MDA含量显著升高；与DM组比较，HSP溶液组及HSP纳米粒组心肌组织SOD、GSH-Px含量显著升高，MDA含量显著下降；与HSP溶液组比较，HSP纳米粒组SOD、GSH-Px含量显著升高，MDA含量显著下降，以上差异均有统计学意义（P＜0.05）（表2）。

表2 各组大鼠心肌组织SOD、MDA及GSH-Px含量比较（n=15，±s）

表2 各组大鼠心肌组织SOD、MDA及GSH-Px含量比较（n=15，±s）

*P＜0.05 vs正常对照组；△P＜0.05 vs DM组；#P＜0.05 vs HSP溶液组

组别 SOD（U/mg） MDA（mmol/mg） GSH-Px（U/L）正常对照组 85.92±12.22 3.18±0.24 57.34±7.63 DM组 47.78±12.64* 4.93±0.32* 40.25±8.93*HSP溶液组 69.74±11.23△ 3.79±0.13△ 52.57±6.13△HSP纳米粒组 79.38±14.45△# 3.32±0.23△# 56.24±7.12△#

2.5 各组大鼠心肌组织caspase-3、Bax和Bcl-2蛋白表达比较

与正常对照组比较，DM组大鼠心肌caspase-3及Bax蛋白表达显著增加，Bcl-2蛋白表达显著下降；与DM组比较，HSP溶液组及HSP纳米粒组大鼠心肌组织caspase-3及Bax蛋白表达显著下降，Bcl-2蛋白表达显著增加；与HSP溶液组比较，HSP纳米粒组大鼠心肌组织caspase-3及Bax蛋白表达显著下降，同时Bcl-2蛋白表达显著增加。以上差异均有统计学意义（P＜0.05）（图3）。

图3 各组大鼠心肌组织caspase-3、Bax和Bcl-2蛋白表达比较

3 讨论

已有研究显示，应用新型的药物递送系统如环糊精包合物[13]及纳米粒[14]等包载难溶性药物HSP有望解决药物在体研究的药代动力学缺陷，实现药物的临床应用研究。本研究应用注入法制备包载难溶性药物HSP的纳米粒溶液，制备的载药纳米粒不仅形态圆整、分散性好，且粒径分散均匀，药物的包封率更是高达（91.23±5.23）%，说明载药纳米粒可以实现对HSP的高包封。研究显示，载体表面的同种电荷产生的静电排斥力是维持载体在水溶液中稳定的关键因素[15]。本研究应用PCL制备载药纳米粒，而PCL表面带有羧基，在水中电离，使得制备的载药纳米粒带负电位，Zeta电位值（-14.5±0.9）mV，且具有一定的稳定性。

据文献报道，大鼠腹腔注射STZ建立Ⅰ型糖尿病模型16周以后，能明显观察到心脏收缩及舒张功能受损，与Ⅰ型糖尿病患者DCM的症状相似，目前多用此方法制备大鼠DCM模型[16-17]。与之前文献报道的结果一致，本研究结果显示，DM大鼠较正常对照组左心室心功能出现了明显损伤，表现为左心室LVESD、LVEDD值显著升高，而LVEF、E/A和LVFS值显著降低，同时DM组大鼠心肌组织排列紊乱，心肌纤维断裂，心肌细胞损伤明显。经过不同形式HSP治疗干预组大鼠的心功能及心肌细胞病理情况较DM组显著改善，表现为LVESD、LVEDD值显著下降，而LVEF、E/A和LVFS值显著升高，心肌组织基本完整，心肌细胞损伤情况较DM组明显改善。同时HSP纳米粒组的大鼠心功能改善较HSP溶液组更加显著，接近于正常对照组水平，说明应用纳米粒包载HSP能够有效增加HSP的在体治疗生物利用度，从而增加HSP对Ⅰ型糖尿病引起的DCM的治疗作用。

氧化应激损伤是引起DCM发生及发展的重要因素。DM大鼠长期处于高糖水平导致机体处于氧化应激状态，体内自由基增多，损伤线粒体DNA，引起细胞凋亡级联反应，最终激活促凋亡蛋白Bax，降低Bcl-2含量，上调细胞凋亡执行蛋白caspase-3表达，从而引起心肌细胞凋亡[18]。与之前研究报道相符，本研究糖尿病组大鼠16周之后心抗氧化酶SOD、GSH-Px含量及Bcl-2蛋白表达较正常组显著下降，同时MDA含量、caspase-3及Bax蛋白表达显著升高，说明DM组大鼠心出现了明显的氧化应激损伤及诱导心肌细胞凋亡增加。应用不同形式HSP治疗能够显著提高心肌抗氧化酶SOD、GSH-Px含量及抗凋亡蛋白Bcl-2的表达，同时减少脂质过氧化产物MDA含量及凋亡相关蛋白Bax、caspase-3表达，说明HSP可能通过抑制氧化应激反应引起的心肌细胞凋亡从而发挥防治DCM的作用。

综上所述，应用纳米粒包载HSP能够有效提高HSP在体应用的生物利用度，从而增加药物防治DCM的效果。HSP在体应用可能通过抑制氧化应激损伤引起的细胞凋亡，从而发挥改善DCM大鼠心功能的作用，有望成为防治DCM的新型治疗药物。