参芪定悸汤调控p38MAPK表达抑制慢性心力衰竭大鼠心肌的氧化损伤

脱梅娟 韩 琳 刘 力 王斌科 杜增平

（宝鸡职业技术学院中医药学院中药教研室，宝鸡 721000）

心力衰竭是由血流动力学负荷过重、炎症等引起的心肌损伤，心肌结构与功能发生异常，致使心室泵血等功能产生障碍[1]。慢性心力衰竭（chronic heart failure，CHF）是持续存在的心力衰竭，老年CHF患者一般是由冠心病、高血压等恶化而来，青年CHF患者主要病因为风湿性心瓣膜病等[2]。常规应用西药治疗CHF，副作用较大，且使患者产生不必要的治疗费用，而中药对人体危害较小，毒副作用较小，且会根据患者的病症及病情辩证治疗。据有关研究表明，中药参芪定悸汤对气虚两亏型室性早搏的治疗效果较好，但对于CHF的治疗效果暂未可知。N端B型脑钠肽前体（N-Terminal pro-B type natriuretic peptide，NT-proBNP）是 脑钠肽前体，是反映心功能的因子。p38丝裂原活化蛋白激酶（p38 mitogemic activated protein kinase，p38MAPK）可将受体传递的信号传入细胞核内，并可调控基因的表达[3]。因此，本研究探讨参芪定悸汤对CHF大鼠心功能、血清NT-proBNP水平和p38MAPK信号通路的作用。

1 材料和方法

1.1 实验动物与分组

健康SD雄性大鼠44只，体质量在200～250 g，购自南京便诊生物公司，随机分为对照组11只、模型组11只、参芪定悸汤低、高剂量组（12.9 g/kg-1·d-1、25.8 g/kg-1·d-1组）各11只，室温饲养，自由进食饮水。参芪定悸汤组成及剂量见表1。下列药物浓度为2.6 g/mL和水（1.3 g/mL）煎剂备用。

表1 参芪定悸汤的组成

1.2 实验试剂

参芪定悸汤所需药材来自诺德原生中草药公司、盐酸阿霉素来自成都乐美天医药公司；HX-300S动物呼吸机来自涵飞医疗器械公司；戊巴比妥那来自斯信生物公司

1.3 模型建立

将盐酸阿霉素用灭菌水溶解，加入生理盐水中使浓度为0.8 mg/mL，注射剂量在2～3 mg/kg。除对照组给予生理盐水外，其余大鼠进行腹腔注射盐酸阿霉素，1次/周、共6周；8 d后大鼠出现中毒症状，表现为精神萎靡、皮毛枯槁、活动能力降低，呼吸加快，左心室短轴缩短率（LVFS）＜30%，表示慢性心力衰竭大鼠模型建立成功[4]。对照组、模型组大鼠不进行任何干预措施；参芪定悸汤低、高剂量组大鼠分别给予参芪定悸汤灌胃，剂量分别为每次12.9 g/kg-1·d-1、25.8 g/kg-1·d-1，1 d 2次，共给予28 d的灌胃。

1.4 检测NT-proBNP和心肌肌钙蛋白I（cTnI）的表达

灌胃结束，禁食、水12 h后，乌拉坦麻醉，动脉取血，离心，提取血清。采用ELISA法检测血清NT-proBNP、cTnI含量。

1.5 检测各组大鼠的心功能

末次灌胃后，各组大鼠禁食不禁水，12 h后进行麻醉，用小动物高频彩色超声系统进行心功能检测，记录大鼠左心室舒张期末压（left ventricular end-diastolic pressure，LVEDP），左心室收缩压（left ventricular systolic pressure，LVSP）。

1.6 免疫印迹检测p38MAPK、p-p38MAPK水平

各组大鼠麻醉后处死，取各组大鼠心肌组织，胰酶消化后提取细胞悬液，保存在-20℃的环境中。将提取出的蛋白溶液和缓冲溶液进行混匀，然后将其煮沸、变性。把电泳后的50 μL蛋白样品转移到PVDF膜上，加脱脂奶粉封闭1 h。加入一抗后PBS漂洗，最后加入二抗。取出PVDF膜，DAB显色后照相。

1.7 检测超氧化物歧酶（superoxide dismutase，SOD）活性和丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量

麻醉大鼠，动脉取血3 mL，离心得血清，SOD活性采用黄嘌呤氧化酶法检测，MDA含量采用硫代巴比妥酸法检测。

1.8 TUNEL及DAPI双荧光染色

取对照组、模型组以及参芪定悸汤低、高剂量组大鼠心肌组织，石蜡包埋，切片（5张）入水，4℃，含0.1%Triton X-100的0.1%枸橼酸钠溶液透化处理4 min，3%双氧水孵育10 min，PBS冲洗3 min×3次，converter-POD 37℃孵育30 min，PBS冲洗3 min×3次，DAB显色剂显色，室温10 min，自来水冲洗，苏木素复染3 min，常规脱水，中性树胶封片，PBS冲洗3 min×3次，DAPI染色液避光室温下染色15 min，PBS冲洗3 min×3次，晾干。将制作完成的病理切片置于荧光显微镜下观察，分析其组织特征并拍照。

1.9 统计学处理

采用SPSS17.0统计学软件进行分析，对照组，模型组，参芪定悸汤低、高剂量组4组大鼠的心功能、NT-proBNP、p38MAPK水平比较采用单因素方差分析，计量资料采用±s，以P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 NT-proBNP和cTnI的表达

对照组大鼠NT-proBNP、cTnI的水平低于模型组（P＜0.05）；模型组NT-proBNP、cTnI的水平高于参芪定悸汤低剂量组与高剂量组（P＜0.05）；高剂量组大鼠NT-proBNP、cTnI的水平低于低剂量组（P＜0.05），CHF大鼠NT-proBNP、cTnI水平呈现高表达，给予参芪定悸汤干预后可降低大鼠NT-proBNP、cTnI表达水平（表2）。

表2 各组大鼠NT-proBNP、cTnI表达水平（n=11，±s，pg/mL）

表2 各组大鼠NT-proBNP、cTnI表达水平（n=11，±s，pg/mL）

*P＜0.05 vs 对照组；#P＜0.05 vs模型组；△P＜0.05 vs参芪定悸汤低剂量

组别 NT-proBNP cTnI对照组 0.31±0.04 132.45±12.57模型组 1.32±0.14* 312.67±30.49*参芪定悸汤低剂量组 1.03±0.11*# 267.21±25.42*#参芪定悸汤高剂量组 0.75±0.09*#△ 238.11±22.64*#△

2.2 各组大鼠心功能指标

对照组LVSP的水平高于模型组，LVEDP的水平低于模型组（P＜0.05）；模型组LVSP的水平低于参芪定悸汤低、高剂量组，LVEDP的水平高于参芪定悸汤低、高剂量组（P＜0.05）；参芪定悸汤高剂量组LVSP的水平高于低剂量组，LVEDP的水平低于低剂量组（P＜0.05）。提示给予参芪定悸汤干预后可改善大鼠心功能（表3）。

表3 各组大鼠心功能指标表达（n=11，±s，mmHg）

表3 各组大鼠心功能指标表达（n=11，±s，mmHg）

*P＜0.05 vs对照组； #P＜0.05 vs模型组；△P＜0.05 vs参芪定悸汤低剂量组

组别 LVEDP LVSP对照组 1.52±0.17 142.35±13.26模型组 8.24±0.41* 83.77±8.92*参芪定悸汤低剂量组 6.37±0.35*# 103.49±10.36*#参芪定悸汤高剂量组 4.22±0.31*#△ 124.67±12.38*#△

2.3 p38MAPK、p-p38MAPK的表达

对照组大鼠心肌组织中p38MAPK、p-p38MAPK的表达低于模型组（P＜0.05）；模型组p38MAPK、p-p38MAPK的表达高于参芪定悸汤低、高剂量组（P＜0.05）；参芪定悸汤高剂量组大鼠心肌组织中p38MAPK、p-p38MAPK的表达低于低剂量组（P＜0.05）。提示给予参芪定悸汤干预后可降低p38MAPK、p-p38MAPK表达水平（图1）。

图1 各组p-p38MAPK、p38MAP表达量比较

2.4 SOD、MDA水平

对照组大鼠SOD的水平高于模型组（P＜0.05），MDA的水平低于模型组（P＜0.05）；模型组SOD的水平低于参芪定悸汤低、高剂量组（P＜0.05），MDA的水平高于参芪定悸汤低、高剂量组（P＜0.05）；参芪定悸汤高剂量组大鼠SOD的表达较低剂量组高，MDA的表达较低剂量组低（P＜0.05）。提示给予参芪定悸汤干预后改善大鼠氧化应激水平（表4）。

表4 各组大鼠SOD、MDA表达水平（n=11，±s）

表4 各组大鼠SOD、MDA表达水平（n=11，±s）

*P＜0.05 vs 对照组；#P＜0.05 vs模型组；△P＜0.05 vs 参芪定悸汤低剂量组

组别 SOD（U/mL） MDA（μmol/L）对照组 165.22±21.37 4.35±1.04模型组 81.45±8.26* 22.31±2.45*参芪定悸汤低剂量组 118.31±12.35*# 12.57±1.49*#参芪定悸汤高剂量组 152.67±15.28*#△ 7.21±1.17*#△

2.5 心肌细胞凋亡情况

正常心肌细胞核显色为蓝色，凋亡小体显色为绿色。可见对照组大鼠存在大量的存活心肌细胞，无明显的心肌细胞凋亡；模型组大鼠正常心肌细胞明显减少，存在大量凋亡小体；参芪定悸汤低剂量组和参芪定悸汤高剂量组与模型组相比，心肌细胞凋亡有所减少（图2）。

图2 各组大鼠心肌细胞凋亡情况，×200

3 讨论

近年来CHF发病率逐渐提升，且其发病的原因复杂多样、病程较长，临床常用治疗药物有β受体阻滞剂、利尿剂等，但此类常见药物副作用较大，安全性欠缺，而中医医药安全、见效快、副作用也较少。因此，本研究采用参芪定悸汤对CHF进行治疗，观察其对心功能及NT-proBNP水平、p38MAPK信号通路的影响。

本研究结果显示，NT-proBNP、cTnI在模型组中为高表达，经过参芪定悸汤干预后水平均有所下降，且以高剂量组下降更为明显。CHF的产生及发展主要依赖于神经系统内分泌过度激活后释放的大量活性物质，此活性物质可使心肌细胞加速坏死、心室重塑，最终加速心衰的发展[5]。心肌细胞、心肌壁、心室容量以及心肌缺血等受刺激时均可产生NT-proBNP，进入血液循环。NT-proBNP可作为CHF患者的诊断指标，具有调控心肌细胞重构及增生的作用。在CHF患者中，心容量超负荷、心压升高会使NT-proBNP的表达提升[6-7]。cTnI可调节横纹肌的收缩，以游离或混合物的形态存在，正常机体中cTnI的表达较少，在机体发生CHF时，患者心脏产生超负荷，神经内分泌被激活过度，使得心肌细胞受损，cTnI由复合物形态转为游离形态，进入血液，使血清中cTnI含量大增[8]。CHF在中医中属“心悸”等范畴，其病因为患者机体心气虚，淤血停留[9]。已有研究证实NT-proBNP与cTnI呈正相关，参芪定悸汤具有补中益气，养心活血，安神定悸之功效，其中黄芪具有强心、治疗表虚及气虚等作用，党参具有养血生津等作用，参芪定悸汤的作用机制可能是通过减少NT-proBNP的产生后使心脏负荷减轻，减少神经内分泌的激活使得cTnI进入血液中的浓度降低，从而改善横纹肌收缩，促使CHF得到改善[10]。曹平等[11]表明黄芪可通过抑制心肌细胞酶活性、提高CHF患者免疫功能、增强SOD活性、降低NT-proBNP水平，从而达到保护心功能的作用，本研究结果与曹平等研究结果相似。

本研究的模型组大鼠LVEDP水平较高、LVSP水平较低，在经过参芪定悸汤干预后LFEDP水平有所下降、LVSP水平有所升高，以高剂量组效果更为明显。LVEDP与LVSP是评价左心室舒缩功能的重要指标，检测其水平变化是研究心功能变化常用的方法。心室重构是CHF的重要特征，其决定CHF的发生及发展。CHF心肌不足以恢复正常室壁张力，使心肌收缩功能异常加剧，LVEDP、LVSP水平变化异常，因此负荷加重，左心室整体功能降低，造成心室重构晚期，心肌细胞增大，CHF病情加重[12-13]。参芪定悸汤中党参具有养血生津等作用，麦冬具有治疗心悸易惊等作用，五味子具有益气生津、宁心等作用。参芪定悸汤对心功能的作用机制可能通过改善心肌细胞受损，减少左心室的重构，改善心肌纤维束间的收缩功能，改善LFEDP、LVSP水平。黄芪是参芪定悸汤中的组成药材之一，黄芪多糖是黄芪的提取物。朱晓雨等[14]研究表明，黄芪多糖可改善心肌功能、抑制心肌纤维化。本研究结果与上述研究结果相似。

本研究结果显示，p38MAPK、p-p38MAPK在模型组中为高表达，在经过参芪定悸汤干预后其表达有所下降，以高剂量组下降更为明显。p38MAPK是细胞内的重要信号通路分子，是MAPK 家族中的四大亚族之一，是介导细胞炎性反应的主要信号通路蛋白[15]。p-p38MAPK是磷酸化的p38MAPK，被上游调控基因或环境相关因素刺激激活后，可以通过磷酸化修饰进而激活多种转录因子，加剧心肌细胞的炎症反应，使其受到损伤[16]。炎症因子通过诱导巨噬细胞的活性、p38MAPK被激活后可诱导心肌细胞的凋亡[17]。参芪定悸汤中茯神、酸枣仁可宁心安神，远志可安神益智。杨桂菊等[18]研究显示，黄芪多糖通过降低p38MAPK-HSP27信号通路的水平，减轻急性坏死性胰腺炎大鼠肺损伤的情况。本研究结果与上述研究结果相似。

本研究结果显示，SOD的水平在模型组中为低表达、MDA的水平为高表达，在经过参芪定悸汤干预后，可改善氧化应激水平，以高剂量组效果更为明显。SOD可通过催化超阴离子自由基歧化生成氧和过氧化氢，在机体氧化与抗氧化中起着重要的作用。MDA、SOD的活性与心衰程度、心功能分级有关，MDA、SOD的活性被释放，产生氧化应激，并促进炎症细胞的分泌，抑制细胞的收缩[19-20]。参芪定悸汤中丹参可活血化瘀、清心除烦，川芎可活血行气、祛风止痛、消炎等。参芪定悸汤的作用机制可能是通过改善心肌缺血及缺氧等状态，降低心肌细胞损伤，使得过氧化减少，从而减轻炎症细胞分泌，对病情具有治疗作用。党璇等[21]提示，丹参、黄芪和葛根通过提高SOD水平、降低MDA水平对脑缺血性再灌注损伤大鼠具有保护作用，同时抑制血栓的形成。本研究与上述研究结果相似。

综上所述，参芪定悸汤可改善CHF大鼠心功能，从而达到对CHF大鼠的治疗效果，其作用机制可能与调控NT-proBNP、p38MAPK的表达有关。本文存在一定的不足，未对p38MAPK水平升高导致p-p38MAPK水平升高进行佐证，在今后的实验中应通过多元化实验方案为CHF提供有力的依据。