BLZ945通过诱导巨噬细胞极化抑制恶性胶质瘤生长*

吴 喆 胡逸萌 曹 冶 刘依婷 李 静 周荟慧 吕建国△ 孙燕玲#

（湖北科技学院，1 基础医学院，2 五官医学院，3 临床医学院&附属第二医院，咸宁 437100）

肿瘤微环境对肿瘤的发生、发展和治疗有重要影响[1]。近年来，人们认识到恶性胶质瘤的生物学行为和临床特征与肿瘤细胞所处的微环境也密切相关[2]，因此激活抗肿瘤免疫，改善恶性胶质瘤免疫微环境，可作为治疗恶性胶质瘤的一个重要策略。分子靶向治疗可激活抗肿瘤免疫，改善肿瘤微环境。巨噬细胞集落刺激因子1受体（macrophage colony stimulating factor 1 receptor，CSF-1R）与肿瘤的发生密切相关，是分子靶向治疗的热点[3-4]。Pyonteck等[5]研究结果表明，CSF-1R抑制剂能够有效减缓肿瘤生长，其机制与巨噬细胞免疫抑制相关表型有关。大量研究显示，肿瘤微环境促使肿瘤相关巨噬细胞（tumor-associated macrophages，TAMs）向M2型分化，存在于肿瘤组织中的TAMs 大部分表现出M2 型巨噬细胞的表型，且与肿瘤的治疗和预后密切相关[6-7]。如果逆转此过程，TAMs 可能通过极化为M1 型发挥抗肿瘤作用[8]。这为恶性胶质瘤的治疗提供了新的思路。因此，本研究通过研究CSF-1R抑制剂BLZ945对恶性胶质瘤的作用，探讨巨噬细胞极化在肿瘤治疗中的分子机制，为BLZ945的临床应用提供理论依据，并为恶性胶质瘤的治疗提供新的靶点。

1 材料和方法

1.1 细胞系和实验动物

大鼠C6胶质瘤细胞株购自武汉大学中国典型培养物保藏中心（CCTCC，武汉），根据美国模式培养物集存库（ATCC）的培养方法进行体外培养。

30只雄性Wistar大鼠，SPF级，5～6周龄，体质量（150±10） g，购自湖北省实验动物研究中心（No.42000600030398）；动物自由饮食进水，动物房温度设定为25℃±2℃，湿度为45%，昼夜交替各12 h。

1.2 主要试剂

BLZ945购自美国ApexBio公司；phorbol 12-myristate 13-acetate（PMA，50 ng/mL）、ionomycin（1 μg/mL）购自美国Sigma公 司；Brefeldin A（1 μg/mL）、anti-CD11b（clone M1/0）、anti-F4/80（clone BM8）、anti-IL-1β （clone NJTEN3）和anti-IL-10（clone JES5-16E3）购自美国eBioscience公司；逆转录试剂盒购自美国Promega公司；RT-PCR Kit购自日本TaKaRa公司；γ-干扰素（interferon，IFN-γ） Rat ELISA Kit购自美国Invitrogen公司；Rat细胞因子信号转导抑制因子3（suppressor of cytokine signaling 3，SOCS3）ELISA Kit购自美国Life Span Biosciences公司。

1.3 动物分组及模型制备

适应喂养1周后，将Wistar大鼠随机分为3组，每组10只：恶性胶质瘤动物模型组（模型组），采用C6胶质瘤细胞构建原位恶性胶质瘤动物模型；BLZ945低剂量治疗组（低剂量组），肿瘤接种7 d后，大鼠接受尾静脉注射BLZ945，注射4次（4～5天1次），注射浓度为0.1 mg/kg，注射体积为10 μL/g；BLZ945高剂量治疗组（高剂量组），注射浓度为1 mg/kg，模型构建和给药方法同低剂量组。

在无菌条件下，10%水合氯醛（0.4 mL/100 g）腹腔注射麻醉大鼠，将动物固定于脑立体定位仪，头顶部正中切口，暴露前囟；将10 μL微量注射器固定于脑立体定位仪，注射针头对准前囟点后调零。注射针尖从前囟往后移1.0 mm，从中线往右移1.0 mm，台式牙钻机钻一个直径为1.0 mm的小孔，微量注射器以1.0 mm/min的速度缓慢进针，往下进针6.0 mm后往后退1.0 mm，注射针尖到达右侧纹状体的注射坐标。10 min内注射肿瘤细胞悬液5 μL（约5×105个），留针5 min，随后按1.0 mm/min的速度缓慢拔针，无菌骨蜡封闭骨孔，医用胶粘合切口。术后每天肌注青霉素，10万U/只，持续5 d。

1.4 肿瘤生长和动物预后观察

观察和记录动物的生存时间。治疗结束后断颈法处死大鼠，开颅取全脑，称取脑组织重量；取矢状轴、水平轴及垂直轴三维参照坐标法分割脑组织块，选择限定于视交叉前l mm 平面至乳头体后缘平面的脑组织块，测量肿瘤最大直径a 及最小直径b（冠状面），根据公式“肿瘤体积（V） = 1/3×（a2×b）×π”计算肿瘤体积，其中a和b以mm测量。

1.5 流式细胞术检测巨噬细胞免疫表型

从肿瘤组织中分离肿瘤浸润淋巴细胞（tumor infiltrating leukocytes，TIL），用Brefeldin A、phorbol 12-myristate 13-acetate和ionomycin重新刺激从肿瘤组织分离的TIL，4～6 h后，先用CD11b和F4/80抗体对细胞进行表面标记，染色后用Fix/Perm溶液处理细胞，同时用IL-1β或IL-10抗体再次标记细胞，对细胞内细胞因子进行染色。

1.6 逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）检测IFN-γ和SOCS3 mRNA表达水平

提取大鼠肿瘤组织RNA并计算RNA浓度，参照逆转录试剂盒要求的标准条件进行逆转录反应。根据GenBank中 大 鼠GAPDH、IFN-γ和SOCS3全序列，取其保守区，按照逆转录-聚合酶链反应引物设计原则设计引物，引物序列由武汉擎科生物技术有限公司合成。PCR引物序列如下：IFN-γ上游引物序列为5′-TGTTACT GCCAAGGCACACT-3′，下游引物序列为5′-TCTG TGGGTTGTTCACCTCG-3′；SOCS3上游引物序列为5′-TCTTTACCACCGACGGAA CC-3′，下游引物序列为5′-GCTAACTGGGAGCTACCGAC-3′；GAPDH上游序列为5′-GCATCTTCTTGTGCAGT GCC-3′，下游序列为5′-CTCGTGGTTCACACCC ATCA-3′。以逆转录后的cDNA为模板，按照RTPCR Kit进行PCR扩增。PCR反应条件为95℃变性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸50 s，共30个循环。凝胶成像仪成像，并照相记录结果。

1.7 酶联免疫吸附测定（ELISA）检测IFN-γ和SOCS3蛋白表达水平

将一部分肿瘤组织（1 cm3）在液氮中冷冻20 min，然后在室温下解冻20 min，冻融循环重复2次；随后用玻璃匀浆器研磨肿瘤组织，并以2 200 r/min离心10 min以除去细胞碎片，并通过0.2 μm过滤器收集上清液。用Rat ELISA Kit检测IFN-γ和SOCS3的表达，严格按照 ELISA 试剂盒说明书进行操作。

1.8 统计学处理

用SPSS 19.0软件对数据进行统计学处理，计量资料用±s表示，组间比较采用t检验，大鼠生存率采用Log-rank检验分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 BLZ945对体内恶性胶质瘤生长的作用

与模型组比较，高剂量组和低剂量组脑重显著减轻，肿瘤体积明显变小（P＜0.05，P＜0.01，P＜0.001）；与低剂量组比较，高剂量组的脑组织重量和肿瘤体积差异有统计学意义（P＜0.05）（图1）。

图1 BLZ945对体内恶性胶质瘤生长的作用

2.2 BLZ945对荷瘤鼠生存率的影响

与模型组比较，高剂量组和低剂量组大鼠生存率显著提高，且高剂量组与低剂量组差异有统计学意义（P＜0.05，P＜0.01）（图2）。

图2 BLZ945对荷瘤鼠生存率的影响

2.3 肿瘤组织中巨噬细胞免疫表型的变化

与模型组比较，高剂量组和低剂量组肿瘤组织中CD11b+F4/80+IL-10+巨噬细胞数量显著降低，CD11b+F4/80+IL-1β+细胞数量显著增加，且高剂量组与低剂量组差异有统计学意义（P＜0.05，P＜0.01）（图3）。

图3 3组肿瘤组织中巨噬细胞免疫表型的变化

2.4 肿瘤组织中IFN-γ和SOCS3的表达水平比较

与模型组比较，高剂量组和低剂量肿瘤组织IFN-γ表达明显上调，SOCS3的表达明显下调（P＜0.01，P＜0.001）；且高剂量组与低剂量组差异有统计学意义（P＜0.05）（图4）。

图4 3组肿瘤组织中IFN-γ和SOCS3的表达水平

3 讨论

胶质瘤是成人最常见的原发性颅内肿瘤，2007年WHO中枢神经系统肿瘤分级将胶质瘤分为Ⅰ～Ⅳ级，其中Ⅲ、Ⅳ级恶性程度高、患者预后差，又称恶性胶质瘤[9]。近30年来，原发性恶性脑肿瘤发生率逐年递增，年增长率约为1.2%。随着人们对恶性胶质瘤认识的不断深入，发现恶性胶质瘤的生物学行为和临床特点不仅取决于肿瘤细胞自身特性，与肿瘤细胞所处的微环境也密切相关[2]。肿瘤微环境中的免疫细胞和肿瘤细胞的相互关系对肿瘤的发生和发展起着重要作用，并最终影响疗效和预后[1]。针对免疫细胞和肿瘤细胞细胞内转导通路上的特异性分子进行靶向治疗是目前胶质瘤研究的热点。

CSF-1R由c-fms原癌基因编码。大量基础及临床研究表明，c-fms基因重复复制、突变、染色体易位以及 CSF-1的过量表达等因素均能异常激活CSF-1R及其介导的胞内信号途径，导致巨噬细胞异常增殖或相关炎症因子的大量表达，最终导致细胞免疫功能紊乱及恶性肿瘤的发生[3-4]。CSF-1R抑制剂的开发已进入快速发展阶段[10]，已有报道证实CSF-1R抑制剂在多种类型的肿瘤如卵巢癌、输卵管癌、腹膜癌、多发性骨髓瘤和三阴乳腺癌中有效[11]。本研究通过脑立体定位仪定向操作成功构建原位恶性神经胶质瘤动物模型，采用CSF-1R抑制剂BLZ945经尾静脉注射进行治疗，结果显示BLZ945高剂量治疗组生存率显著提高，脑重显著降低，颅内肿瘤体积明显减小，表明BLZ945能有效抑制恶性胶质瘤的生长，并显著提高荷瘤鼠的生存率。

肿瘤细胞分泌多种细胞因子，作用于周围的免疫细胞包括巨噬细胞、肥大细胞、自然杀伤细胞等，免疫细胞转变为促肿瘤表型，协助肿瘤免疫逃逸及远处转移，导致免疫抑制[12]。TAMs来源于未成熟的单核细胞，被大量肿瘤源性细胞因子如CSF-1、IL-6、IL-10以及一系列化学趋化因子等募集到肿瘤区域。TAMs 在肿瘤微环境的诱导下发生表型和功能的转换，并再产生趋化因子、生长因子、血管生成因子和基质蛋白酶等化学因子作用于肿瘤细胞，进而促进肿瘤生长、侵袭与转移[13-14]。Cao等[15]研究显示M2 型巨噬细胞增加肿瘤恶性程度，并最终促进肿瘤细胞的聚集和生长。如果逆转这个过程，TAMs 可能通过重新极化为M1 型而发挥抗肿瘤作用[8]。本研究结果显示，BLZ945降低了肿瘤组织中CD11b+F4/80+IL-10+巨噬细胞的数量，增加了CD11b+F4/80+IL-1β+细胞的数量，前者由于IL-10的产生更倾向于是抑制性亚群，后者由于IL-1β的产生更倾向于是炎症性亚群，表明BLZ945可诱导肿瘤微环境中的巨噬细胞向M1型极化。

巨噬细胞的极化是一个多因子相互作用的复杂过程，细胞因子通过与巨噬细胞膜表面的特异性受体结合，触发细胞内多种信号转导途径。Duluc等[16]研究显示，IFN-γ 能将人卵巢癌的TAMs转化为M1型，从而激活抗肿瘤免疫。Qin等[17]将从髓系细胞敲除了SOCS3基因的LysMCre-SOCS3fl/fl小鼠中提取的巨噬细胞与SOCS3fl/fl小鼠相比，M1型标志物表达显著上升。本研究结果显示高剂量组肿瘤组织中SOCS3的表达下调，IFN-γ的表达上调，提示BLZ945通过调节IFN-γ和SOCS3的表达，诱导巨噬细胞由M2 型 向M1型极化。

肿瘤微环境中肿瘤细胞来源的微颗粒可诱导TAM向M2 型分化，进而促进肿瘤的生长、转移和肿瘤干细胞的发展[18]。在此基础上，本研究用大鼠C6胶质瘤细胞在Wistar 大鼠上成功构建原位恶性神经胶质瘤动物模型，进一步研究表明，CSF-1R 抑制剂BLZ945可明显抑制恶性胶质瘤的生长，并显著提高荷瘤鼠的生存率，流式细胞术结果则表明BLZ945可诱导肿瘤微环境中的巨噬细胞向M1型极化，而通过RT-PCR和ELISA结果分析表明BLZ945可上调肿瘤组织中IFN-γ的表达，并下调SOCS3的表达。

综上所述，CSF-1R抑制剂BLZ945通过调节IFN-γ和SOCS3的表达，诱导巨噬细胞由M2 型 向M1 型极化，激活抗肿瘤免疫，进而抑制恶性胶质瘤的生长，为恶性胶质瘤生物治疗提供新的路径，并为恶性胶质瘤免疫治疗提供新的靶点。