一种烟碱固体脂质纳米粒杀虫剂的制备与优化

林建胡， 林文雄

(1.莆田学院 教务处， 福建 莆田 351100； 2.福建农林大学 农业生态研究所， 福州 350002)

0 引言

研发环境友好型的杀虫剂对保护生态环境和人类健康具有重要意义.烟碱(nicotine)是烟草中含量最高的生物碱[1]，它能通过与乙酰胆碱受体结合而阻断昆虫神经系统信号的正常传导，进而导致昆虫活动减少和无法觅食[2-4].除此，烟碱还可以起到杀卵的作用，特别是对软体幼虫以及蚜虫的防治具有较好的效果[5-6]：因此，烟碱目前已被作为广谱杀虫剂应用于农业生产中[7].相比其他新型烟碱类农药[8]，烟碱易被光和空气氧化而失去抗虫活性[9]，因此制备烟碱类杀虫剂时，既需要考虑其药效时长，又要考虑其对人体的毒副作用及对环境的影响.目前，国内外开发应用的烟碱农药主要有乳油、水剂、微乳、微囊、纳米粒和纳米脂质药物偶联物[10]等制剂，但是这些制剂在制备[3]或使用过程[4，11]中会影响生态；因此，需要开发一种对环境友好的新型烟碱制剂.

由于固体脂质纳米粒具有易于制备、成本低、稳定性好的优点，因此常用来替代脂质体、微乳和聚合物纳米粒[12-13].鉴于此，本文利用高压匀质法[14]制备了一种烟碱固体脂质纳米粒(nicotine loaded solid lipid nanoparticles, N-SLN)，并筛选出最优处方和最佳工艺.

1 实验材料与方法

1.1 材料

仪器： 1700型紫外可见分光光度计(日本岛津有限公司)； Nano ZS纳米粒径电位分析仪、Mastersizer 2000激光粒度分析仪(英国马尔文仪器有限公司)； Moticam 3.0 MP显微镜(厦门麦克奥迪实业集团有限公司)； Micron LAB 40高压匀质机(德国APV公司)；差式扫描量热仪(上海梅特勒-托利多国际贸易有限公司); L-60型超速离心机(美国贝克曼库尔特公司).

试剂：三肉豆蔻酸甘油酯Dynasan®114、三硬脂酸甘油酯Dynasan®118 (上海帝科精细化工有限公司)；氢化葵花籽油(法国Société Industrielle des Oléagineux公司)； 烟碱(98%，德国Alfa Aesar公司)； PVA30000/PVA60000/PVA125000(美国Sigma-Aldrich公司)；Tween®20/Tween®60/Tween®80 (上海阿拉丁试剂有限公司)； Poloxamer 188/Poloxamer 407(德国Alfa Aesar公司)； PVP K25/PVP K30(连云港荣禾新)；Na2CO3-NaHCO3缓冲液(pH 9.0，北京诺博莱德科技有限公司)；铝制坩埚(上海笛柏实验设备有限公司).

1.2 脂质材料对烟碱溶解性的考察

称取等量的三肉豆蔻酸甘油酯(Dynasan®114)、三硬脂酸甘油酯(Dynasan®118)和氢化葵花籽油(hydrogenated sunflower oil，HSO)分装在玻璃瓶中，然后将玻璃瓶加热至80 ℃；待脂质熔融后分别向玻璃瓶中滴加质量分数为7%、10%和20%的烟碱，并轻晃玻璃瓶使之溶解.常温下滚动瓶壁，使液体在玻璃瓶壁上凝固成均匀的薄层.通过肉眼观察筛选出能融合烟碱的脂质，备用.在筛选出的熔融脂质中继续滴加质量分数为25%和50%的烟碱，且在脂质未凝固前将其滴加到载玻片上，用显微镜观察脂质凝固后的形态.当脂质凝固在瓶壁时，利用差式扫描量热法(differential scanning calorimetier， DSC)测定烟碱在脂质中的最大包封量.称取含有2 mg烟碱的凝固脂质置于铝制坩埚中进行DSC分析.DSC分析时，以空的铝制坩埚为参比，氮气(99%)为保护气，温度设定程序为25 ℃→-140 ℃(停留10 min)→ 95 ℃(停留10 min)→ 20 ℃，升温(降温)速率为10 ℃/min.

1.3 乳化剂的筛选

利用高压匀质法制备N-SLN，处方为脂质材料8.5%(3.4 g)、烟碱1.5%(0.6 g)、乳化剂2.0%(0.8 g)和加至40 g的0.01 mol/L的Na2CO3-NaHCO3缓冲液(pH 9.0).N-SLN的制备流程如图1所示.在缓冲液中加入0.8 g的乳化剂，搅拌均匀后水浴加热至80 ℃(形成水相).将0.6 g的烟碱滴入80 ℃的脂质中(形成油相).将油相缓慢加入到水相中后立刻使用高剪切分散乳化机(上海壹维机电设备有限公司，SAII-2)在8 000 r/min速度下持续剪切1 min，然后将混合物转移至85 ℃的高压匀质机中循环(压力为600 bar)；将所得产物倒入80 ℃的玻璃瓶中，冷却至室温后即得N-SLN.取制备的N-SLN 10 μL，用5 mL超纯水(Dura 12型，美国泽拉布有限公司)稀释，然后利用纳米粒度仪(光子相关光谱法，photon correlation spectroscopy， PCS)和激光粒度仪测定N-SLN的平均粒径和粒径分布情况[15].

图1 N-SLN的制备流程

1.4 稳定性的考察

将筛选出的乳化剂处方按1.3中的制备方法分别高压循环1、 3、 5、 7、 10次，然后将其分别在室温下放置1、 7、 30 d.按1.3中的方法考察上述N-SLN的平均粒径和粒径的分布情况，同时利用显微镜观察是否有大颗粒存在.选择出最优处方后，利用Nano ZS纳米粒径电位分析仪对最优处方下制备的N-SLN进行电位测定.

1.5 包封率的测定

将不加烟碱的空白固体脂质纳米粒用甲醇破乳后，用0.01 mol/L的Na2CO3-NaHCO3缓冲液将其稀释，然后利用紫外-可见光分光光度计在200～800 nm范围内对其进行扫描；对比所得的扫描峰与烟碱的扫描峰，以此确定烟碱的最大吸收峰.称取40 mg烟碱置于100 mL的容量瓶中作为标准储备液(400 μg/mL).分别量取该溶液30、40、60、80、100 μL置于10 mL容量瓶中，用Na2CO3-NaHCO3缓冲液定容后得到系列质量浓度分别为12、16、24、32、40 μg/mL的标准液，然后用吸光度A对质量浓度C(μg/mL)做标准曲线.移取5 mL在最优处方下制备的N-SLN，室温下超速(120 000×g)离心5 h； 溶液过50 nm的滤膜，续滤液用缓冲液稀释后用紫外分光光度计测定烟碱的吸光度；将吸光度代入标准曲线得到游离药物的浓度(Cfree)， 并将其作为未包封的量.另取N-SLN 5 mL， 用甲醇超声10 min(破乳)后将其定容至50 mL； 溶液过50 nm滤膜，续滤液用超纯水稀释后测定烟碱的吸光度.根据吸光度计算出药物的总浓度(Ctotal)， 并将其作为药物的总浓度.包封率(EE)的计算公式为：

EE=(Ctotal-Cfree)/Ctotal×100%.

(1)

2 结果与分析

2.1 脂质材料对烟碱溶解性的考察

研究表明，对药物溶解性高的脂质材料通常具有较高的载药能力[16].由图2可以看出，三肉豆蔻酸甘油酯或三硬脂酸甘油酯与烟碱融合凝固后，其表层有淡黄色的渗出物(黑色虚线内)，这表明二者均无法溶解质量分数大于7%的烟碱.而当质量分数为7%、10%和20%的烟碱融入HSO后，其凝固层为纯白色，表明HSO对烟碱的溶解度高于三肉豆蔻酸甘油酯和三硬脂酸甘油酯，因此本文将HSO作为N-SLN的脂质材料.

图2 不同质量分数的烟碱对不同脂质外观的影响

在HSO中继续滴加质量分数为25%的烟碱时，HSO的外观与滴加质量分数为20%的烟碱时无明显差异(图3 A)，但当滴入质量分数为50%的烟碱时，可明显观察到全部脂质被渗出的黄色物质覆盖(推测黄色物质是超过包封能力的烟碱).由图3B可以看出：在显微镜下，当滴加烟碱的质量分数为0%～25%时，HSO为均匀的晶态；而滴加烟碱的质量分数为50%时，HSO为液滴态(推测该液滴是超过包封能力的烟碱).图4是HSO包封质量分数为20%、25%、50%烟碱后的DSC曲线.由图4可知，上述推测是正确的.

图3 不同烟碱量在HSO中的包封能力(A为外观图，B为显微观察(×600))

图4 HSO包封不同量烟碱后的DSC曲线

由图4还可以看出，烟碱在-83 ℃左右有1个放热峰.当质量分数为20%和25%的烟碱加入到HSO后，位于-83 ℃左右的放热峰消失，说明质量分数为20%和25%的烟碱均可成功包封于HSO中.而当烟碱的质量分数增加到50%时，在-83 ℃左右又出现了放热峰，说明HSO无法包封质量分数为50%的烟碱.另外，脂质材料的熔融温度随烟碱质量分数的增加出现了下降的趋势，如包封烟碱的质量分数为20%、25%、50%时，其熔融温度分别为67 ℃、64 ℃、59 ℃.这种温度变化说明,加入烟碱会使脂质内部的结构趋于无序[16].

2.2 乳化剂的筛选

研究[15]显示，固体脂质纳米粒易于出现胶凝现象，进而影响溶液的稳定性.本文实验发现，用超纯水取代缓冲液制备N-SLN仍会出现胶凝现象,因此本文以粒径的大小和均一性为指标，通过筛选乳化剂来延缓胶凝.在初步筛选乳化剂的过程中发现：由Tween®20、60、80制备的固体脂质纳米粒在制备当天(室温下)就发生了胶凝现象;由Poloxamer 188制备的固体脂质纳米粒放置1 d (室温下)后出现了胶凝现象;由Poloxamer 407、PVP K25、 PVP K30制备的固体脂质纳米粒在放置9 d (室温下)后出现了胶凝现象.以上表面活性剂使N-SLN在短期内就出现胶凝现象的原因可能是这些表面活性剂的稳定性较低，难以稳定由烟碱、HSO和Na2CO3-NaHCO3缓冲液(0.01 mol/L)形成的三维网络结构[17].在30 d内未出现胶凝现象的有PVA 30000、PVA 61000和PVA 125000， 其原因可能是PVA在晶体表面具有较强的吸附能力，且其长链可阻碍微粒的相互接近，因此可有效阻碍胶凝现象的发生[15].

将PVA系列乳化剂分别进行1、3、5、7、10次高压匀质循环，并考察制备当天和7 d后的粒径变化.由图5可知， PVA 125000循环3次时，N-SLN的PCS平均粒径和50%颗粒的粒径分布上限 [d(v)50%] 均在500 nm左右， 99%颗粒的粒径分布上限 [d(v)99%] 均大于1 μm，且多分散指数(PDI)在0.3附近.这说明循环3次的固体脂质纳米粒虽然粒径较为均一，但仍有1%左右的大颗粒.PVA 30000循环3次时， N-SLN的PCS平均粒径和d(v)50%均在200 nm左右，但d(v)99%大于4 μm.这说明PVA 30000作为乳化剂时得到的纳米颗粒粒径虽然大部分在200 nm左右，但仍存在小部分的大颗粒.产生大颗粒的原因可能是由Ostwald熟化作用导致N-SLN的混悬液不稳定造成的[15].PVA 61000循环7次和10次时， N-SLN的PCS平均粒径均小于500 nm，d(v)99%均小于1 μm， 且PDI在0.2附近，这说明由PVA 61000制备的N-SLN粒径大小均一、稳定.其原因可能与PVA的性质(分子量越大,稳定性越强，亲水性越弱)有关[18].基于上述结果，本文将PVA 61000作为制备N-SLN的考察对象.

图5 不同PVA系列乳化剂对烟碱固体脂质纳米粒粒径的影响

2.3 稳定性的考察

图6为以最优处方制备的N-SLN在放置30 d时的粒径变化.由图6A可知，乳化剂PVA 61000分别循环7次和10次时所制备的N-SLN在30 d内其d(v)99%均小于1 μm，即所制备的N-SLN在30 d内(室温下)其粒径仍可保持在纳米级别.其中循环7次的N-SLN的PCS平均粒径、d(v)50%和d(v)99%在制备当天的数据与30 d后的数据相近，且PDI的变化也较小(由0.227变为0.264);循环10次的N-SLN虽然其d(v)50%和d(v)99%在制备当天的数据与30 d后的数据也相近，但PCS平均粒径在30 d后增加了约100 nm， PDI也由0.220变为0.318.循环10次制备的N-SLN的粒径变化相对较大的原因可能是循环次数越多，制剂获得的能量越多，进而更容易导致颗粒聚集[19].图6 B进一步证实了上述结果.

由于烟碱(pKa=8.02)在pH 9.0的缓冲液中会以去质子态存在(易溶于脂质)[20]，所以本文选用pH 9.0的Na2CO3-NaHCO3缓冲液(0.01 mol/L)来增加烟碱的包封率.通常脂质在处方中的质量比一般小于10%(大于10%会影响粒径的稳定性)，考虑到比例过小会影响载药效果，故本实验在前期预实验基础上将脂质的比例确定为8.5%.对在最优处方(PVA 61000 2.0%、烟碱1.5%、HSO 8.5%、 88%的Na2CO3-NaHCO3缓冲液(pH 9.0))和最佳工艺(600 bar、 85 ℃的高压匀质机中循环7次)下制备的N-SLN进行电位测定显示，该N-SLN在溶液中的zeta电位为-33.2 mV.由于zeta电位绝对值大于30 mV即可证明其稳定性[21]，由此可推测在该最优处方下制备的N-SLN可保持长久的稳定性.

图6 N-SLN 30 d后的粒径稳定性(A为循环次数对粒径的影响；B为显微观察(×600))

2.4 包封率的测定

为了测定烟碱在最优处方中的包封率，对烟碱缓冲液和空白固体脂质纳米粒的紫外扫描图(图7 A)进行对比分析.由图7 A可知， 261 nm可作为检测烟碱的最大吸收峰，且在该波长下空白固体脂质纳米粒不会对烟碱的测定产生影响．以烟碱标准液的质量浓度C(μg/mL)为横坐标(x)、吸光度A为纵坐标(y)作图，由此得烟碱的标准曲线回归方程：y=0.020 2x-0.002 2，R2=0.999 7， 如图7 B所示.由图可以看出，在12～40 μg/mL范围内，吸光度与质量浓度呈良好的线性关系.根据公式(1)计算得最优处方的包封率为(12.3±4.2)%.

图7 烟碱溶液的最大吸收峰(A)和标准曲线(B)

3 结论

研究表明：N-SLN的最优处方为1.5%的烟碱、 2.0%的PVA 61000、 8.5%的HSO和88.0%的Na2CO3-NaHCO3缓冲液(pH 9.0).制备N-SLN的最佳工艺为利用高压匀质机在600 bar压力、 85 ℃条件下循环7次.在最优处方和最佳工艺下制备的N-SLN可在30 d内保持稳定.本文研究结果可为开发环境友好型农药新制剂提供良好参考.在本文的研究中，烟碱的载药量还有待进一步提高，今后我们将通过筛选更多的固体脂质来提高N-SLN的载药量.