基于两面针新棒状花椒酰胺含量的动态累积研究

黄光伟 黄 静 梁雪松 李月菲

(柳州两面针股份有限公司，广西 柳州 545006)

两面针是广西的优势道地药材之一。两面针具有解毒消肿、气止痛、活血化瘀、祛风通络等作用，广泛应用于中医处方、中成药及日化产品中，它的提取物是两面针中药牙膏的主要功效物质，药用部位为芸香科植物两面针Zanthoaylum nitidum(Roxb．)DC．的干燥根[1]。两面针药材及其相关产品已成为振兴广西经济的特色产业之一。

长期以来，国内外学者对两面针的本草考证、生药学、化学成分、药理作用、临床应用等方面进行了较全面的研究[2]。研究表明，两面针药材中的化学成分较复杂，其茎皮、根和根皮中含有生物碱类、木脂素类、黄酮类、甾醇类等多种化合物，其中生物碱是两面针主要的化学成分之一。2005年，刘绍华博士进行了“两面针镇痛、抗炎和止血活性成分的研究和应用”的研究，研究发现，在两面针药材中，除了生物碱类具有生物学活性外，其中的新棒状花椒酰胺也具有显著的镇痛、抗炎和止血生物学活性[3]。

对于两面针不同生长期和不同部位的活性成分含量，已有文献报道[4-6]，但绝大多数是以氯化两面针碱作为评价指标成分，且没有足够的时间跨度进行系统研究。本研究利用我公司拥有两面针GAP种植研究基地种植的药材在时间跨度上超过10年以上的便利条件，对不同年份、同年而不同月份的两面针药材，采用高效液相色谱法检测其用药部位根部中新棒状酰胺的质量分数，考察该指标成分在不同生长期内的动态累积变化，探讨两面针药材中该指标成分的变化规律，为合理采收及使用两面针药材提供可靠依据。

1 材料

1.1 药材

采自位于南宁市良庆区锦亮村两面针GAP种植研究基地，由研究基地的技术人员进行鉴定并采集。

1.2 仪器和试剂

Agilent 1200高效液相色谱系统(配有色谱工作站和DAD检测器)，美国Agilent公司；AND HM-200电子天平，日本AND公司；RE52-98旋转蒸发器，上海亚荣生化仪器厂；As3120 超声清洗仪，Automatic科学仪器公司；中药切片机(青州三阳包装设备有限公司)；250 mL索氏提取器；植物粉碎机(型号FZ102，天津市泰斯特仪器有限公司)。乙腈，色谱纯，国药集团化学试剂有限公司；甲醇，色谱纯，Fisher公司；超纯水，电阻率18 MΩ·cm。新棒状花椒酰胺对照品，由柳州两面针股份有限公司功效研究组人员制备。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱为Eclipse XDB-C18高效液相色谱柱(4.6×250mm，5μm)，C18保护柱，检测波长为275 nm，柱温为40 ℃，流动相为乙腈∶水=60∶40，流速为1.0mL/min，进样量为20μL，采用外标法定量。对照品的液相色谱图见图1。两面针药材中新棒状花椒酰胺的液相色谱图见图2。

图1 对照品的液相色谱图(1-新棒状花椒酰胺)

图2 供试品的液相色谱图(1-新棒状花椒酰胺)

2.2 对照品溶液的制备

精密称取0.001g新棒状花椒酰胺对照品于100mL容量瓶中，用甲醇溶解定容，摇匀，作为对照品溶液，避光保存备用。

2.3 供试品溶液的制备

选取生长期为2、3、5、7、10、13年生的两面针药材，选取已有5年生长期的两面针药材，每隔两个月取同株根部的根须，分别用切片机切成片状，再用粉碎机碎成3mm左右的细粉。精密称取各试验样品细粉5.00g，置于索式提取器中，加90mL甲醇，加热至微沸，冷凝回流提取至提取液无色后停止，提取液移出，用甲醇定容至100mL，避光保存备用。

2.4 标准曲线和线性回归方程

准确量取对照品溶液0.50mL、1.00mL、2.00mL、4.00mL、8.00mL于10mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，摇匀，得对照品溶液。取各浓度对照品溶液20μL，按上述色谱条件进样测定，每个浓度进样3次，以平均峰面积(Y)为纵坐标，对应的浓度(X)为横坐标作标准曲线和线性回归方程，得回归方程：

Y=9160399.52X+0.3038515

r=0.9999

结果表明，在0.50～8.00μg/mL范围内新棒状花椒酰胺的质量浓度与峰面积的线性关系良好。

2.5 精密度试验

取同一供试品溶液，连续进样6次，测定新棒状花椒酰胺的质量分数，其RSD为0．95%，表明精密度良好。

2.6 稳定性试验

取同一供试品溶液，分别在0、2、4、6、8、10、12h测定新棒状花椒酰胺的质量分数，计算结果RSD为1.23%。该结果表明供试品溶液在12h内保持稳定。

2.7 重复性试验

取同一药材共5份，每份约1.0g，精密称定，分别制备供试品溶液并测定新棒状花椒酰胺的质量分数，结果RSD为1.53%，表明重复性良好。

2.8 加样回收试验

称取已知新棒状花椒酰胺质量分数的药材约1.0g，共6份，按2.3方法制备供试品溶液，分别精密加入适量对照品溶液并测定各供试品新棒状花椒酰胺的质量分数。结果平均回收率为99．07%，RSD为1．61%。

2.9 样品测定

分别取上述不同生长期的两面针药材约1.0g，精密称定，按2.3方法制备供试品溶液，按2.1色谱条件测定各供试品溶液中新棒状花椒酰胺的质量分数，每个样品测定3次，取平均值，各测定结果见表1、表2。

表1 不同生长年份两面针药材新棒状花椒酰胺的测定结果(n=3)

表2 5年生不同月份两面针药材新棒状花椒酰胺的测定结果(n=3)

3 讨论

药材的生长受当地的海拔、水土、气候等环境因素影响很大，不同产地的药材质量存在较大偏差。本实验所用的两面针药材均采自位于南宁良庆区锦亮村的两面针GAP种植研究基地，该基地的药材生长环境相同，并种植有不同年份的药材，可供研究需要选择适宜的药材，样品具有代表性。检测结果表明，3年生长年期的两面针药材新棒状花椒酰胺质量分数已达到较高值，5生长年期的两面针药材新棒状花椒酰胺质量分数达到峰值，之后呈现一个平稳的状态，生长期超过10年的两面针药材新棒状花椒酰胺质量分数呈下降趋势；对于同一年的药材，在每年的前半年，两面针新棒状花椒酰胺质量分数呈小幅下降趋势，而下半年则呈上升趋势，12月达到高峰。

两面针药材中新棒状花椒酰胺和氯化两面针碱都是主要生物活性物质，两者都是衡量和控制两面针药材质量的重要指标。本研究结果显示，不同生长期和不同季节的两面针药材，其新棒状花椒酰胺质量分数存在一个动态累积变化的过程，3年生长期的两面针即可采收，有5年生长期的最佳；而对于同期的药材，10～12月份新棒状花椒酰胺质量分数达到最高，而这个季节也正是气候比较干燥的时期，有利于药材的晾晒和保存。